[发明专利]一种动物角膜长期培养评价眼刺激性损伤及修复的方法

权利要求书

1.一种动物角膜长期培养评价眼刺激性损伤及修复的方法，其特征是包括以下步骤：

步骤1.离体角膜制备；

步骤2.角膜长期培养：

取清洗干净的角膜，上皮面朝下悬浮于添加有HBSS液的6孔板、12孔板或直径35 mm的培养皿，使角膜完全浸没于培养液；

将融解状态的0.5-5%的琼脂-明胶-M199混合物,缓慢逐滴每次2-3滴加入角膜窝内皮面，直至内皮窝完全填满，琼脂-明胶-M199混合物在室温下完全凝固；

将充满凝固的琼脂-明胶-M199混合物的角膜倒置，转移到若干35 mm培养皿中；

吸取40-60ml的M199培养基加入每个培养皿中，直到覆盖角膜缘，裸露角膜上皮面暴露于空气中；

将培养皿置于小型振荡器上，置于32^oC±2^oC、5%CO₂、90%相对湿度的培养箱中培养8-24h，小型振荡器应使培养皿在每2h-3h内从水平位置摇动到45°角，使得角膜可以短暂浸泡在培养基中浸润上皮组织；

步骤3.角膜化学损伤模型及评价；

步骤4.角膜物理损伤模型及评价；

步骤5.角膜损伤后修复作用评估：

（1）化合物损伤角膜后，将角膜转移到新的培养皿中，取40ml新的M199培养基加入每个培养皿中，后孵育2小时；更换含有活性物质表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或维生素的M199培养基，置于32^oC ±2^oC、5% CO₂、90% 相对湿度的培养箱，按步骤2角膜长期培养方法继续培养至第14天；实验组平行样20-30个；含活性物质的M199培养基为活性修复组，不含活性物质的M199培养基为自然修复组，同时设空白对照或基准对照；

（2）培养期间，每2天更换含活性物质的M199培养液；分别于化学损伤后的第2h、14h、26h、38h、50h、62h、74h、86h、98h、110、170h和14d±2h的时间点，取培养液进行细胞因子测试，并取实验组其中2-3只角膜进行浊度测试、电阻测试、荧光素评分和组织学观察，其余角膜继续培养；

（3）角膜液细胞因子测试：在更换新的培养液前，从培养皿中移出培养液，检测培养液中的炎性因子和修复因子水平：包括IL-1a、IL-6、IL-8；

（4）浊度变化：浊度检测前，从培养皿中取出角膜，将其固定于夹持器中，夹持器的后室和前室分别依次填充无菌不含酚红的MEM培养基，用角膜浊度仪测量并记录每个角膜的浊度值，来自不同组的角膜分别记录浊度值，OP_活性h，OP_修复h，OP_空白；计算实验组与空白组的浊度差值；

（5）电阻测定和荧光素观察：测完浊度后，用电阻仪测定角膜的电阻值；然后从夹持器中取下角膜，上表面滴入含2% 荧光素钠NaFL的PBS；过量的NaFL立即用PBS冲洗，在紫外灯下观察NaFL的潴留，潴留的程度表明角膜损伤的严重性；

计算潴留面积S占整个角膜面积C的百分比值，根据S/C值对损伤/恢复程度进行评分；0分：2%，1分：2～25%， 2分：26～50%，3分：51～75%，4分：76%～100%；

（6）组织学评价：荧光素评分完成后，取角膜加入10%中性福尔马林缓冲液中固定24h；石蜡包埋、切片、取部分切片进行HE染色；显微镜下观察并评估组织学变化；

取部分切片进行免疫组化染色：角膜上皮细胞紧密连接蛋白Occludin或ZO-1的染色或钙粘连蛋白染色，用于观察角膜修复过程中，上皮屏障功能的改善情况；

步骤6.统计分析与结果判定

将上述步骤获得的各组实验数据，以均数±标准差表示，采用 SPSS22.0 统计软件进行分析，多组之间差异的比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验法，显著性水平α=0.05，p＜0.05表示差异具有统计学意义；

化学损伤后修复综合分析角膜电阻值、荧光素染色、浊度测试、炎性因子检测和组织学观察结果；机械损伤修复不进行电阻测试和浊度测试；紫外线损伤后修复参考化学损伤；

根据不同检测参数的意义，从统计结果分析，作出修复作用的综合判断：

（1）电阻测定和荧光素染色：随着培养时间的延长，自然修复组和活性修复组电阻值逐渐升高；荧光素染色的S/C的比值逐渐下降，评分降低；自然修复组和活性修复组与空白对照相比，S/C的比值具有统计学差异p＜0.05；活性修复组与自然修复组相比，电阻值的增高具有统计学意义，荧光素滞留的评分值相差1级以上，认为活性物质对修复有促进作用；

（2）浊度测试：随着培养时间的延长，自然修复组和活性修复组浊度OP的值逐渐下降；修复组与空白对照相比的浊度差值逐渐缩小；活性修复组与自然修复组相比，2个时间点以上，浊度差值相比具有统计学差异p＜0.05，认为活性物质对修复有促进作用；

（3）炎性因子检测：随着培养时间的延长，自然修复组和活性修复组炎性因子的数值应呈下降或升高趋势，且具有统计学差异p＜0.05；同一时间下，活性修复组与自然修复组相比，特征性炎性因子或修复因子的水平具有统计学差异，提示活性物质对修复有促进作用；

（4）组织学观察：通过HE染色和免疫组化染色，观察角膜的组织学变化，并详细记录：

角膜化学刺激性损伤发生后，组织学表现为上皮的明显缺损，上皮细胞缺失、通透性增加，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin结构消失；随时间推移，上皮细胞增殖并向缺损处迁徙，其通透性逐渐降低，紧密连接蛋白结构逐渐形成；24h时后，上皮细胞覆盖角膜上皮缺损处，但其通透性仍较正常组高，其细胞间紧密连接松散、排列紊乱；48h后，角膜通透性恢复正常，其角膜上皮细胞连接紧密，细胞间形成紧密连接结构；如果促进修复组与自然修复组相比，组织学修复时间缩短12h以上或修复程度提高，即相似组织学结构和特征观察的时间提前12小时以上，提示活性物质对修复有促进作用；

步骤4物理刺激损伤角膜模型及评价包括以下子步骤：

（1）角膜培养24h后，从培养皿中吸出培养液；把直径1.0cm的聚四氟乙烯树脂O-形环置于角膜；用无菌的眼科手术刀片在眼角膜中央刮除直径为8mm的角膜中央上皮，深及角膜上皮细胞基底层，制备机械性角膜损伤模型；每个损伤模型使用6-10个角膜；每个模型取其中的2只角膜进行如下刺激程度评估测试：

（2）荧光素观察：同步骤5之（5）；NaFL染色显示损伤的角膜，黄色区域的大小表示损伤的严重程度；

（3）物理刺激模型引进的组织学评价：同步骤5之（6）；

（4）物理损伤角膜评价：

荧光素染色评分若不满足损伤面积＞50%，小于75%，则认为损伤程度过于严重，不能用于损伤修复评估；

组织学检查：角膜损伤后，出现上皮的明显缺损，表现为上皮细胞缺失，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin结构消失；基质层上层断裂或缺失，物理因素导致的组织学损伤应与荧光素染色对应；

（5）剩余的角膜浸没于含有40-60ml M199培养基的培养皿中，置于32^oC±2^oC、5%CO₂、90%相对湿度的培养箱，按步骤2角膜长期培养方法继续培养，进行后续自然修复或促进修复作用研究；

（6）同时设置阴性对照，阴性对照为去离子水，均采用相同的操作步骤。