[发明专利]抗CK7蛋白单克隆抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合CK7蛋白的单克隆抗体UMAB161、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术

CKs(细胞角蛋白)主要分布于上皮细胞，是上皮组织分化的基本标记物。它是角质细胞中的主要骨架蛋白，主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性。CKs家族至少包含20种不同分子，包括酸性角蛋白(I型角蛋白，角蛋白9-23)和碱性角蛋白(II型角蛋白，角蛋白1至8)，其表达取决于细胞类型和分化位置，是一种常用的肿瘤免疫组织化学标记物，在许多上皮肿瘤细胞的鉴别诊断中扮演重要角色。研究表明，角蛋白基因突变与皮肤病、肝脏和胰腺疾病以及炎性肠道疾病有关。

CK7又名KRT7或SCL，是CKs家族中的一员，属于II型角蛋白。CK7主要表达在简单上皮细胞、间皮细胞、尿路上皮细胞和假复层上皮细胞，在胃窝、肠和分层鳞状上皮细胞中的表达低或不可检测。因大多数上皮癌细胞均表达CK7，所以其与CK20的协调表达通常用作各种上皮细胞癌症的诊断标记。目前临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对CK7蛋白的单克隆抗体对IHC检测CK7表达水平具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的CK7蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测CK7蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2017年4月6日，保藏编号为CGMCC No.13820。

本发明还提供了一种特异性结合CK7蛋白的单克隆抗体UMAB161，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据CK7 ORF核苷酸序列(CK7 ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1410bp；CK7氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

设计引物PCR扩增CK7 ORF第1bp位到第345bp位序列和第1023bp位到第1410bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pET23a-N-His，构建CK7重组表达质粒pET23a-His-rCK7

(2)CK7重组蛋白的表达与纯化：将CK7重组表达质粒转化Ecoli，裂解离心获得可溶性蛋白，镍亲和层析柱纯化，获得纯化的CK7重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的CK7重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗CK7特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为UMAB161，亚型鉴定为IgG1；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得CK7单克隆抗体UMAB161。分别通过Western Blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

本发明还提供了单克隆抗体UMAB161在制备用于检测CK7蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体UMAB161，可检测组织细胞中CK7的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与CK7的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等相关肿瘤组织。

与现有技术相比，本发明提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.13820)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体UMAB161。本发明还提供了单克隆抗体UMAB161在制备用于检测CK7蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体UMAB161的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体UMAB161在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与CK7蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了CK7蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤浸润细胞内CK7蛋白表达水平，可应用于肾癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等相关肿瘤免疫微环境的检测。

保藏信息