[发明专利]用于简单异尖线虫/派氏异尖线虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列

说明书

本发明公开了用于简单异尖线虫/派氏异尖线虫的LAMP‑LFD检测的引物和探针序列，特点是包括三对LAMP的引物AniITS‑F3、EtaompA‑B3；AniITS‑FIP、AniITS‑BIP；AniITS‑LF、AniITS‑LB；和一条探针AniITS‑HP，核苷酸序列如SEQ NO1‑NO7所示，利用上述的引物和探针，通过LAMP反应体系扩增步骤，探针杂交LAMP反应产物步骤，使用LFD检测步骤实现简单异尖线虫/派氏异尖线虫的可视化检测，优点是检测速度快，完成整个检测仅需50min，省时省力，对仪器设备依赖性小，更加适用于基层机构和现场疫源地检测。

技术领域

本发明涉及一种检测异尖线虫的引物和探针序列，尤其是涉及一种用于简单异尖线虫/派氏异尖线虫LAMP-LFD检测的引物和探针序列。

背景技术

异尖线虫（Anisakis spp.）通常寄生于硬骨鱼类的内脏和肌肉组织中，当人食用生的、半成品的或者腌制的鱼时会引起过敏症状，导致异尖线虫病。随着食用生鲜鱼片的普及，异尖线虫病发病率逐年增加。2013年《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》将异尖线虫病列为二类传染病，这种传染病在一定程度上限制了海产品的进出口贸易（http://www.aqsiq.gov.cn）。异尖线虫病的感染主要与简单异尖线虫（A. simplex）相关。研究表明，异尖线虫有三个姐妹种，分别为简单异尖线虫（A. simplex s. str.）、派氏异尖线虫（A. pegreffii）和C型异尖线虫（A. simplex C）三种，其中简单异尖线虫和派氏异尖线虫分布非常广泛，有研究表明简单异尖线虫和派氏异尖线虫在鱼类和头足类动物中感染率达到80％。而且，这两种线虫在中国的寄生较为广泛。因此，建立快速、准确、灵敏的检测简单异尖线虫/派氏异尖线虫的新方法，对于疾病的早期诊断和预警、实时监测，具有重要的意义。

目前，异尖线虫物种主要通过传统的形态学观察来鉴定。然而，此方法检测周期较长，且需要专业人士进行操作。近年来，国内外有许多学者建立了基于PCR的分子鉴定手段：SSCP法，常规PCR，多重PCR，PCR-RFLP和核糖体DNA和线粒体DNA测序法。这些分子的方法都需要复杂的仪器设备和专业的技术人员。

Notomi报道的环介导的等温扩增（LAMP）可在等温条件下更加快速和便捷的完成检测，这项技术吸引了各个领域的关注。LAMP产物可通过琼脂糖凝胶电泳（AGE）显现的梯状条带，裸眼观察浊度计和核酸染色（SYBR Green I，钙黄绿素等）等方法检测。虽然基于荧光的实时监控也可方便直观的检测，但是实时荧光仪器的价格较高。横向流动试纸条（LFD）是一种新型的方法，它能够高效、准确的检测LAMP产物。利用生物素标记的LAMP产物与异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）标记的探针进行特异性杂交，杂交产物与LFD上的抗FITC的抗体结合，形成免疫复合物。当其通过LFD的检测线时会被生物素配体所捕获，结合在检测线；未被捕获的将通过检测线，结合在质控线上。这种方法最初应用于检测水生病原体，病毒和细菌方面，如今在兽医和植物病害的检测中也得到了一定的应用。目前，国内外还未见报道将该技术应用于简单异尖线虫/派氏异尖线虫的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和准确性高的用于简单异尖线虫/派氏异尖线虫的LAMP-LFD检测的引物和探针序列。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于简单异尖线虫/派氏异尖线虫的LAMP-LFD检测的引物和探针序列，其根据简单异尖线虫/派氏异尖线虫（GenBank登录号：KU991876）的rDNA-ITS2区段设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：

AniITS-F3：5’- GAATTGCAGACACATTGAGC -3’