[发明专利]用于克隆茶树LOB基因的引物及其克隆方法和应用

权利要求书

1.茶树LOB基因，其特征在于该基因的核苷酸序列为SEQ ID No.8。

2.用于克隆茶树LOB基因的引物组，其特征在于所述引物组序列如下：

CsLOB-F：5’-ATGGCGTCGTCATCAAACTCATACAAC-3’；

CsLOB-R：5’-TCAAATATTTCCTCCAGAAGGGCTATTG-3’。

3.一种克隆茶树LOB基因的方法，其特征在于茶树LOB基因如权利要求1所述；

该方法包括以下步骤：

步骤（1）、茶树总RNA的提取和反转录；

步骤（2）、茶树LOB基因保守序列的扩增；具体是：

根据已知其它物种LOB基因的氨基酸及核苷酸序列设计得到扩增茶树LOB基因保守序列的引物LOB-degenerate-F和LOB-degenerate-R，以龙井长叶cDNA为模板，扩增得到茶树LOB基因保守域的序列；

LOB-degenerate-F：5’-TGYGCBGCSTGCAARTT-3’；

LOB-degenerate-R：5’-GAKATDGCDCCDACRCAGCC-3’；

茶树LOB基因保守域的核苷酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2；

扩增反应程序为94℃3min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35 Cycles，72℃ 10min；

步骤（3）、茶树LOB基因5’RACE和3’RACE扩增；

步骤（4）、茶树LOB基因全长cDNA扩增；

步骤（5）、PCR产物的克隆纯化与筛选。

4.根据权利要求3所述的克隆茶树LOB基因的方法，其特征在于步骤（3）具体是：

3.1 茶树LOB基因5’末端扩增反应

首先以TaKaRa 5’-Full Race Kit提供的5’RACE Outer primer和基因特异引物CsLOB-5’RACE-GSP1为引物，龙井长叶cDNA为模板，进行5’末端Outer PCR反应；然后再以5’RACE Inner prime和基因特异引物CsLOB-5’RACE-GSP2为引物，以0.5μl Outer PCR产物为模板，进行茶树LOB基因5’末端Inner PCR反应；

5’RACE Outer primer：5’-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3’；

5’RACE Inner primer：5’-CGCGGATCCAC AGCCTACTGATGATCAGTCGA TG-3’；

CsLOB-5’RACE-GSP1：5’-AGGAGTTGACTGCGTCTTCACGTTGGTG-3’；

CsLOB-5’RACE-GSP2：5’-GAGCTTCGTGACGTTGCTTGCTCCAAAG-3’；

Outer PCR反应的扩增体系为龙井长叶cDNA 2μl，1×cDNA Dilution Buffer II 8μl，10×LA 不含Mg²⁺的PCR Buffer 4μl，25mM MgCl₂ 3μl，5U/μl TaKaRa LA Taq 0.25μl，10μMCsLOB-5’RACE-GSP1 2μl，10μM 5’RACE Outer primer 2μl，dH₂O 28.75μl；

Outer PCR反应条件为94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，20 Cycles，72℃10min；

Inner PCR反应的扩增体系为Outer PCR产物0.5μl，1×cDNA Dilution Buffer II 8μl，10×LA 不含Mg²⁺的PCR Buffer 4μl，25mM MgCl₂ 3μl，5U/μl TaKaRa LA Taq 0.25μl，10μM CsLOB-5’RACE-GSP2 2μl，10μM 5’RACE Inner prime 2μl，dH₂O 28.75μl；

Inner PCR反应条件为94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，20 Cycles，72℃10min；

3.2 茶树LOB基因3’末端扩增反应

首先以TaKaRa 3’-Full Race Kit提供的3’RACE Outer primer和基因特异引物CsLOB-3’RACE-GSP1为引物，龙井长叶cDNA为模板，进行3’末端Outer PCR反应；然后再以3’RACE Inner primer和基因特异引物CsLOB-3’RACE-GSP2为引物，以0.5μl Outer PCR产物为模板，进行茶树LOB基因3’末端Inner PCR反应；

3’RACE Outer primer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’；

3’RACE Outer primer：5’-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’；

CsLOB-3’RACE-GSP1：5’-TGCAAGTTTCTTCGCCGGAAATGCATGC-3’；

CsLOB-3’RACE-GSP2：5’-GAGCCACACAAATTCGCCAACGTCCAC-3’；

Outer PCR反应的扩增体系为龙井长叶cDNA 2μl，1×cDNA Dilution Buffer II 8μl，10×LA 不含Mg²⁺的PCR Buffer 4μl，25mM Mgcl₂3μl，5U/μl TaKaRa LA Taq 0.25μl，10μMCsLOB-3’RACE-GSP1 2μl，10μM 3’RACE Outer primer 2μl，dH₂O 28.75μl；

Outer PCR反应的PCR反应条件为94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，20Cycles，72℃ 10min；

Inner PCR反应的扩增体系为Outer PCR产物0.5μl，1×cDNA Dilution Buffer II 8μl，10×LA 不含Mg²⁺的PCR Buffer 4μl，25mM Mgcl₂ 3μl，5U/μl TaKaRa LA Taq 0.25μl，10μM CsLOB-3’RACE-GSP2 2μl，10μM 3’RACE Inner primer 2μl，dH₂O 28.75μl；

Inner PCR反应的PCR反应条件为94℃ 3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，20Cycles，72℃ 10min。