[发明专利]一种热稳定性提高的β-淀粉酶突变体

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的β‑淀粉酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过对弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)来源的β‑淀粉酶进行定向进化的研究，利用进化最常用的方法之一易错PCR技术对亲本β‑淀粉酶进行热稳定性的筛选，最终得到了一株热稳定性显著提高的β‑淀粉酶突变体。本发明突变体Thr461Tyr/Asp506Asn/Asp519Lys在55℃下的半衰期比野生型β‑淀粉酶提高了2倍，在55‑65℃范围内始终保持较高的酶活力。本发明得到的突变体比野生型β‑淀粉酶更加适用于淀粉糖的工业应用。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的β-淀粉酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

β-淀粉酶又称为麦芽糖苷酶、糖原淀粉酶，其系统名为α-1,4-葡聚糖-4-麦芽糖水解酶(α-1,4-Dglucan maltohydrolase)，E.C.编号为3.2.1.2.作用于淀粉时，从其非还原性末端顺次切下麦芽糖，水解产物是β-麦芽糖、β-极限糊精及非常少量的β-葡萄糖。β-淀粉酶具有相当大的工业应用价值，长期以来植物来源的大麦β-淀粉酶一直被广泛用于多个领域。例如，在啤酒发酵业中部分代替大麦芽用于啤酒的生产，在食品业中用于水解淀粉制造麦芽糖浆和饴糖等。自1974年Higashihara等人首次确定巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)胞外淀粉酶含有β-淀粉酶以来，相继发现了几种能够产生该酶的微生物，这些菌株大都属于细菌，如蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、高温放线菌(Thermeoactinomyces sp.)和热硫梭菌(Clostridium thermosulfurogenes)等。与植物β-淀粉酶相比，微生物来源的β-淀粉酶具有便于大规模工业化生产的优点，因此筛选寻找理想的微生物β-淀粉酶源成为淀粉酶研究应用领域的一个重要目标。

定向进化属于蛋白质的非理性设计，不需要事先了解蛋白质的结构、催化机制、保守序列等因素，而是通过模拟自然进化机制来为酶基因创造体外进化的条件，进而对目的蛋白进行分子改造，并定向筛选研究进化酶的酶学性质。易错PCR技术是目前应用最广泛的定向进化方法之一，具有操作方便、快速、高效的优点。对于微生物来源β-淀粉酶的研究，目前主要是围绕不同宿主的克隆表达、酶学定性，而针对其酶学性质的分子改造显得较少，在定向进化研究其热稳定性方面，尚未见相关文献报道。

发明人在前期的研究中从菜地土壤中成功的筛选到了一株高产β-淀粉酶的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)CCTCC 2015368的菌株，并将该菌株的β-淀粉酶基因序列克隆出来，成功的在大肠杆菌(Escherichia coli)宿主中表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种热稳定性提高的β-淀粉酶突变体。

所述热稳定性提高的β-淀粉酶突变体，是对亲本弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)CCTCC 2015368β-淀粉酶进行定向进化，通过分子进化的手段之一易错PCR技术，获得β-淀粉酶突变体。亲本β-淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。采用“原始氨基酸-替换位置-突变后氨基酸”来表示β-淀粉酶突变体，β-淀粉酶突变体为Thr461Tyr/Asp506Asn/Asp519Lys，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

用于表达所述的β-淀粉酶突变体的表达载体为pET24a(+)；

用于所述的表达载体转化的微生物宿主为大肠杆菌(Escherichia coli)。