[发明专利]用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组及其应用

说明书

本发明提供了用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组以及使用所述引物组扩增样品中多个目标DNA序列的方法，所述引物组包括针对每个目标DNA序列的多对上下游特异性引物：每对所述上下游特异性引物包括针对目标序列的特异性序列，所述特异性序列之间满足如下条件：(1)与目标序列之外的序列不发生扩增、(2)之间不形成二聚体、(3)不形成发卡结构；在所述特异性序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列；在所述特异性序列的3’端有增加空间位阻的修饰，所述修饰不阻断其与所述特异性序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其与不完全匹配的模板的结合与延伸。

本申请是申请日为2016年5月6日，申请号为201610293653.2，发明名称 为“用于扩增样品中多个目标DNA序列的引物组及其应用”的发明专利申请的 分案申请。

技术领域

本发明涉及核酸序列的捕获、富集与分析。更具体来说，本发明涉及基于多 重PCR的目标序列富集方法。

背景技术

全基因组测序可以获得全基因组水平范围的突变、插入、缺失以及结构变异。 然而，由于基因组容量巨大，以30×进行测序就会产生接近100G的数据量。而 肿瘤等相关的低突变频率测序则需要至少1000×的覆盖度，如果进行全基因组 测序，则会产生3000G的数据量。这样规模的数据量除了会对数据的分析工作 造成极大的困难，还会显著增加测序的成本，进而制约测序的应用。为了解决这 个难题，目标区域捕获技术应运而生。

目标区域捕获技术是指通过特定的技术手段定向捕获目标区域的核酸序列， 然后进行建库测序，以达到在对目标区域进行深度测序的目的的同时使得测序成 本大大降低。PCR是一种常见的用于富集目标区域的技术，更为常见的是利用 多重PCR技术一次性的捕获多个目标区域。多重PCR适用于热点区域或者长度 较小的目标区域的捕获。制约多重PCR技术应用的两个重要因素是非特异扩增 和二聚体的产生。

因此，本领域中需要能有效降低非特异扩增和二聚体产生的多重PCR技术 出现。

发明内容

本发明提供了基于多重PCR扩增的目标序列富集方法，所述方法包括：兼 容性多重PCR引物的筛选；进行第一轮特异性多重PCR扩增；进行第二轮通用 引物扩增富集；回收产物并上机测序。

因此，在第一方面，本发明提供了用于扩增样品中多个目标DNA序列的引 物组，所述引物组包括针对每个目标DNA序列的多对上下游特异性引物，其中：

a)每对所述上下游特异性引物包括针对目标序列的特异性序列，所有特异 性序列之间满足如下条件：(1)每个特异性序列与目标序列之外的序列不发生扩 增，(2)特异性序列之间不形成二聚体，(3)特异性序列不形成发卡结构；

b)在所述特异性序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列；

c)在所述特异性序列的3’端的碱基处有增加空间位阻的修饰，所述修饰不 阻断其与所述特异性序列完全匹配的模板的结合与延伸，但基本阻断其与不完全 匹配的模板的结合与延伸。

在一个具体的实施方案中，所述特异性序列之间满足如下条件：(1)所述特 异性序列与目标区域的Tm–与非目标区域的Tm≥5℃，优选≥10℃；(2)所述 特异性序列与目标区域的Tm–与其他特异性序列形成二聚体的Tm≥5℃，优选 ≥10℃；(3)所述特异性序列与目标区域的Tm–形成发卡结构的Tm≥5℃，优 选≥10℃，优选Tm的值基于SantaLucia 2007热力学参数表的最邻近法计算。