[发明专利]病毒复制受转录抑制型Tet-on系统调控的条件复制腺病毒载体及应用

说明书

本发明公开了一种病毒复制受TetR‑KRAB介导的转录抑制型Tet‑on系统调控的条件复制型腺病毒载体，腺病毒E1区包含元件及连接顺序为5’‑CMV启动子、TetR‑KRAB基因、含四环素反应元件的启动子TRE3G‑E1b Pro、EcoRⅠ酶切位点、缺失E1BΔ55KD蛋白的腺病毒E1A‑E1B 19KD基因序列、酶切位点SpeⅠ、mRNA转录终止信号SV40polyA‑3’；CMV启动子表达转录抑制因子TetR‑KRAB；两个酶切位点EcoRⅠ和SpeⅠ中插入的基因序列为腺病毒E1A翻译起始位点至腺病毒E1B 19KD蛋白终止密码子基因片段，包含四环素反应元件的启动子TRE3G‑E1b Pro表达腺病毒E1A基因，腺病毒E1B 19KD基因则由其自身的启动子表达，经过包装获得的腺病毒命名为Ad5‑CMV‑TetR‑KRAB‑TRE3G‑E1b Pro‑Δ55KD。经申请人的试验表明，该病毒装载于间充质干细胞内可以进行肿瘤治疗研究中的应用。

技术领域

本发明涉及生命科学领域的腺病毒载体及其应用，具体涉及一种病毒复制受TetR-KRAB介导的转录抑制型Tet-on系统调控的条件复制腺病毒载体及其应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的最主要疾病。尽管传统治疗手段应用广泛，但因为缺乏肿瘤特异性，常会对正常细胞造成较大的毒副作用。条件复制型腺病毒(CRAd)，是在腺病毒的基础上发展而来的一类用于肿瘤基因治疗的新型病毒，该病毒可在肿瘤细胞内特异性扩增，但在正常细胞中不复制，或者复制很弱，所以也称为溶瘤腺病毒(oncolyticAdenovirus)。目前CRAd主要分三类：(1)Ad5E1B区55KD缺失的Ad5E1B△55KD(如ONYX-015)，它可以在p53功能异常的肿瘤细胞内复制，而在正常细胞内不能复制。(2)Ad5E1ACR2区的24bp(919-943)碱基序列缺失的Ad5D24，其可在Rb功能异常的肿瘤细胞内大量复制。(3)利用肿瘤特异性启动子表达复制相关基因，使病毒在特定肿瘤特异性启动子活性较高的肿瘤细胞中特异性扩增。

条件复制型腺病毒在肿瘤治疗中应用广泛，但依然存在一些缺点如：免疫原性高，肝脏毒性大，肿瘤治疗时以肿瘤内局部注射给药为主，投递方式受限制，感染范围有限，复制特异性不严谨，病毒安全性有不足等。

已有研究表明，使用人间充质干细胞(Human Mesenchymal stem cell，简称hMSC)来装载和投送条件复制型腺病毒载体，进行体内的基因治疗，可以克服上述的条件复制型腺病毒载体在应用中的缺陷。hMSC作为运载细胞而装载病毒时，病毒可以在hMSC中进行复制和扩增，最后病毒复制裂解hMSC，释放病毒到肿瘤组织，实现病毒投送。但病毒在hMSC中的复制会导致hMSC的活力受到影响，减弱其迁移与归巢的活力，进而影响其投送病毒的能力。因此，条件复制型腺病毒在hMSC细胞中的装载量会受到限制，需要在病毒装载量和细胞归巢活力之间取得平衡。当病毒装载量过多时，hMSC可能因为病毒的复制而失去活力甚至被裂解，导致无法有效投送病毒到达肿瘤组织中。因此，严格控制病毒的复制，除了有利于病毒治疗的安全性外，也能提高hMSC投送腺病毒的效果。使用调控系统控制病毒复制，在hMSC未到达肿瘤细胞之前，细胞内装载的病毒不复制，当hMSC迁移到肿瘤组织后，再开启病毒复制，如此可在获得最大的病毒装载量的同时，避免病毒复制对hMSC活力的影响。并且，这种方式可以精确控制病毒的释放，使hMSC到达肿瘤组织后释放病毒，避免病毒对正常组织和细胞的影响。