[发明专利]靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞、制备方法及应用

权利要求书

1.靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，表面表达靶向CD19的嵌合抗原受体基因，其特征在于，

所述靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构域、4-1BB的胞内信号结构域以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，

CD19的单链抗体CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化而得，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1或2所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)CD19-CAR慢病毒载体的构建

在上述靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点，与慢病毒表达载体Plv-EF1a双酶切，回收DNA片段，连接，转化，挑取单克隆，提取质粒，经过酶切和测序鉴定，得CD19-CAR慢病毒载体Plv-EF1a-CD19ScFv；

(2)慢病毒的制备

提取慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv,辅助质粒psPAX2和pMD2.G，测定质粒浓度，配制转染体系，转染HEK293T/17细胞，分离得慢病毒浓缩液；

(3)T细胞的分离和培养

取健康外周血，分离淋巴细胞，刺激培养24-48h。

(4)T细胞的感染和扩增

将上述刺激培养的T细胞接种到培养板，加入步骤(2)的慢病毒浓缩液，感染8-12h，获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞。

4.根据权利要求3所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，

在上述靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点BamH1和Sal1,与慢病毒表达载体Plv-EF1a用限制性内切酶BamH1和Sal1进行双酶切。

5.根据权利要求3所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，

所述配制转染体系，转染HEK293T/17细胞，分离得慢病毒浓缩液的具体操作为：

取细胞状态良好的HEK293T/17细胞培养，将表达质粒Plv-EF1a或Plv-EF1a-CD19ScFv，辅助质粒psPAX2和pMD2.G以9:6:3的质量比与LipoFilter转染试剂以及无血清DMEM培养基配制转染体系，孵育后共转染HEK293T/17细胞，12h后更换培养液；

分别在转染换液后24h、48h时收集病毒上清，离心，过滤，过滤后的病毒液超速离心，弃掉上清，沉淀用无血清培养液重悬，得慢病毒浓缩液。

6.根据权利要求3所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，

所述T细胞的分离和培养的具体操作为：

取健康外周血，离心后留自体血浆备用，剩余血细胞用等体积生理盐水稀释，加入到淋巴细胞分离液的上层，离心，吸取中间白膜层细胞，加入生理盐水洗涤，离心，得分离的淋巴细胞；

分离后的淋巴细胞用T淋巴细胞培养液加2％体积的自体血浆重悬，并调整细胞密度，接种于浓度为5ug/ml的CD3和CD28抗体包被的培养板中，刺激培养24h-48h。

7.根据权利要求6所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，

含有2％体积的自体血浆的培养板中补充终浓度为500U/ml的重组人白介素2，25ng/ml的重组人白介素7和50ng/ml的重组人白介素15。

8.权利要求1或2所述的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞在制备抗B细胞恶性肿瘤药物中的应用。