[发明专利]一种高通量表达单克隆抗体的线性表达框

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种抗体线性表达框，具体涉及一种可以高通量表达单克隆抗体的线性表达框。

背景技术

自20世纪80年代以来，单克隆抗体与基因工程抗体技术取得了快速的发展。抗体技术经历了鼠源杂交瘤、噬菌体展示抗体文库技术、核糖体展示抗体文库技术、EB病毒转化B细胞永生化技术、流式分选单个B细胞技术(single cell sorting)等，使得制备抗体的方式呈现多元化，每个方法都在不断完善相关技术细节，从而使得抗体制备显得相对容易。目前抗体研究方向已从最初的鼠源抗体转向了人源单克隆抗体和基因工程抗体，从专注于单个抗体的功能到研究整个抗体组学的相关信息。同时，随着晶体衍射和冷冻电镜技术的发展，抗体的抗原识别位点和抗体-抗原复合物的三维结构也成为目前研究的一个热点。此外，现阶段大量抗体药物的上市，治疗型抗体也成为一个快速发展的行业。

基因工程抗体技术都需要对抗体基因进行克隆和表达，并从海量的待选抗体中筛选出功能特异的目标抗体。高通量构建抗体表达系统和抗体的高通量表达是实现高通量筛选的基础。传统的抗体表达需要将抗体基因克隆到真核表达载体中，然后将真核表达质粒转染到宿主细胞中进行抗体的表达。每个抗体需根据抗体可变区的序列设计两对独特引物，PCR扩增轻链和重链基因，切胶回收基因片段后经特异性酶切位点与表达载体连接、转化感受态菌。然后挑取单个菌落测序，筛选阳性重组克隆，再制备质粒，瞬时转染细胞表达抗体。此过程是一个完整的分子克隆，步骤繁琐，耗时较长，无法实现高通量操作。由于前期筛选的抗体或者单个B细胞的特异性不高，有活性的目的抗体的数量只占全部表达抗体很少的一部分。这使得目的抗体的获得不但费时费力，而且试剂耗材消耗量巨大，前期成本比较大，且实验成功率较低。

综上所述，目前制备抗体的方法较多，且比较成熟。而抗体的高通量表达和筛选技术非常单一，从出现基因工程抗体以来，似乎从来没有出现过革命性的变革。不但步骤繁琐、耗时耗力，而且成本很高，最主要是无法实现抗体高通量的表达和筛选，成为制约抗体技术发展的瓶颈。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种诱导抗体快速少量表达的线性表达框，以满足对抗体快速高通量表达以及前期初筛的需求。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种抗体线性表达框，所述抗体线性表达框包括顺次连接的以下几个表达元件：翻译启动子、抗体信号肽编码序列、抗体重链可变区编码序列、连接区编码序列、抗体轻链可变区编码序列、终止子。

进一步，所述翻译启动子可以是选自组成型启动子、组织特异性启动子、细胞特异性启动子、响应于生理信号的启动子或可调节启动子中的任意一种，只要可以启动抗体表达的启动子即可。

适用于控制抗体编码序列表达的组成型启动子的实例包括但不限于鸡R一肌动蛋白(CB)或来自其他种类的R肌动蛋白启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期启动子、U6启动子、金属硫蛋白启动子、EFla启动子、泛素启动子、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子，腺苷脱氨酶启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、丙酮酸激酶启动子、磷酸甘油变位酶启动子、p-肌动蛋白启动子、单纯疽疹病毒的胸普激酶启动子以及本领域技术人员己知的其他组成型启动子。

其他启动子可以包括例如人巨细胞病毒(CMV)立即-早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、JC多瘤病毒启动子、髓磷脂碱性蛋白((MBP)或神经胶质元纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、单纯疤疹病毒(HSV-1)潜伏相关启动子((LAP)、劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)启动子、神经元特异性启动子((NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)启动子、hSYN、黑素浓集激素((MCH)启动子、CBA、神经胶质元纤维酸性蛋白(GFAP)启动子、基质金属蛋白启动子((MPP)、以及鸡p-肌动蛋白启动子。

在本发明的具体实施方案中，所述翻译启动子是CMV立即-早期增强子/启动子，序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述抗体信号肽的序列是抗体翻译过程中的前导序列，mRNA转录完成以后，信号肽在核糖体上首先被翻译出来，然后结合信号肽识别颗粒，信号肽识别颗粒将核糖体携带至内质网中继续翻译下游的抗体成分。在信号肽的引导下，新合成的抗体蛋白进入内质网腔进行翻译后修饰，而信号肽序列则在信号肽酶作用下被切除。抗体的信号肽作用如下：

1)信号肽能够引导分泌蛋白或膜蛋白出胞；