[发明专利]用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开一种用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用，所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测志贺氏菌，所述检测方法以志贺氏菌ipaH基因为靶基因，建立了一种可以有效检测志贺氏菌的实时荧光RPA方法。该方法特异性强，灵敏度高，检测限为3.5×10^‑3ng/μL，在39°C恒温下仅需要20min即可完成检测，检测时间仅为7‑12min，可以实现对食品样品中志贺氏菌的有效检测，并可以用于现场检测，为食品和食源性公共卫生事件中的志贺氏菌的检测提供了一种新方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于志贺氏菌的检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

食源性疾病目前是全世界关注的重要公共卫生问题，无论在发达国家还是发展中国家，每年都会有数千万的人因感染食源性致病菌而发病，严重者导致死亡。志贺氏菌(Shigella)作为主要的食源性致病菌之一，在我国引起感染性腹泻的致病菌中居首位。志贺氏菌属由4种革兰氏阴性、非运动性、无芽孢形成的杆状细菌组成，分别是鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌。毒力较强的志贺氏菌可以引起人类细菌性痢疾，可表现出轻度痢疾、发热、腹部绞痛以及严重的体液流失。

目前的分子生物学检测方法可以有效地克服传统检测方法的部分劣势而被多数研究者所青睐，其中重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技术因其特异性强、灵敏性高、反应时间短、操作简便等优点而受到广泛的关注，具有巨大的发展前景。

传统的志贺氏菌检测主要依赖于细菌培养及一系列的生化鉴定，检测周期较长，无法实现快速检测。目前已建立了多种志贺氏菌的检测方法。常规的检验程序需要增菌、选择性平板分离培养、生化试验、血清学分离鉴定等，耗时长，操作繁琐，难以满足大批量样品检测或突发公共卫生事件处理的需求。在分子生物学检测方面，常用的方法包括聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增法(LAMP)和基因芯片技术等。PCR反应由变性、退火、延伸三个基本步骤构成，反应完成后进行电泳检测，必要时需要对产物进行纯化或测序分析，一般需要经验丰富的技术人员进行操作，且需要昂贵的PCR仪。LAMP扩增目的片段时依赖于一种具有链置换特性的DNA聚合酶和4-6条能够识别靶序列六个特异区域的引物，引物设计较为繁琐，其扩增产物经电泳检测呈现出梯度条带，不易与非特异性条带区分。

发明内容

针对现有志贺氏菌检测程序复杂、引物设计繁琐、仪器昂贵等问题，本发明提供一种用于志贺氏菌的检测试剂盒。

进一步地，本发明还提用于志贺氏菌的检测方法及应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种用于志贺氏菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒用于实时荧光RPA检测志贺氏菌，以志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因作为靶基因，根据其保守序列设计有一对引物和一条探针，

其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：

上游引物：5'-CTGCATGGCTGGAAAAACTCAGTGCCTCTG-3'

下游引物：5'-GTTCTGACTTTATCCCGGGCAATGTCCTCC-3'

探针：5'-CCATCAGGCATCTGAAGGCCTTTTCGA-FAM-dT-THF-A-BHQ1-dT-GATACCGGCGCTCTGCTC-C3-3'。

进一步地，本发明还提供一种用于志贺氏菌的检测方法，所述检测方法为实时荧光RPA方法，所述检测方法至少包括以下步骤：

步骤1、从待测样品中提取基因组DNA；