[发明专利]一种表达miRNA的AAV辅助包装载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达miRNA的AAV辅助包装载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用；所述载体基于Rep2与CapDJ辅助包装载体，在CMV启动子驱动下的miR33‑5’UTR和miR33‑3’UTR之间插入克隆miRNA的位点2×BsmBI，miRNA表达小片段连接入所述骨架载体的2xBsmBI位点。所述载体的构建方法包括：制备克隆用骨架；制备miRNA表达小片段；将miRNA表达小片段连接至克隆用骨架载体上。所述筛选方法包括：用所述载体转化Stbl3感受态细菌，质粒提取；将提取的质粒共转染293T细胞；滴度比较筛选。本发明实现提高AAV生产效率约50％以上。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达miRNA的AAV辅助包装载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用。

背景技术

目前基因治疗从近几十年来无数科学家的梦想正逐步变成了现实。基因治疗的载体一直是整个基因治疗的关键：需要能满足安全性、有效性、特异性。多种病毒、非病毒载体经过多年的演变、淘汰，目前重组腺相关病毒(rAAV)载体是公认为符合以上三个标准的基因治疗载体。由于AAV的生产得率长期以来提升缓慢，因而临床应用的普及程度也受此制约。随着近几年来第一个被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物Glybera上市，Spark Theraputics公司的治疗先天性失明的SPK-RPE65三期临床表现优秀，AAV作为基因治疗载体的方向与道路已完全被证明，但AAV的生产效率仍是基因治疗的关键瓶颈。一个需要全身性转导的遗传疾病需要AAV约1x 10¹⁵AAV基因组拷贝数(GC)的颗粒，而这个临床级别的生产量需要50万美元。生产上，如果用目前实验室能力范围内一次50个15cm盘可获得得1x10^13GC的生产效率来计算，则需要要生产100次或100倍的生产规模才能得到治疗一个病人的总量。

因此，AAV的产量瓶颈亟待打破。目前AAV的主流生产方法是三质粒转染293T细胞方法。三质粒转染法简单、快速，但由于293T为贴壁细胞，这种方法在规模上的扩展较有困难。但如果能把贴壁细胞驯化为悬浮细胞，则该方法会打破自身的局限，成为规模化工业生产的重要候选方案。把贴壁的293T细胞驯化为悬浮细胞近几年已有人取得成功，但由于原本的生产效率仍是未能满足需求，因此规模化生产只能靠单一地增加生产规模。因此，在方法上改进、创新，取得更高的AAV产率是目前基因治疗的热点之一。

发明内容

有鉴于此，有必要针对的问题，提供一种表达miRNA的载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用，所述载体用作miRNA的表达，以提高AAV生产；所述构建方法、筛选平台实现高通量处理各环节，省去各个载体单独克隆及测序验证的步骤，从而在得到有效筛选结果的基础上节省大量资源与人力。

本发明通过以下技术方案实现：

一种基于常规的Rep2与CapDJ辅助包装载体的表达miRNA的载体，结构如图1所示，在Rep2与CapDJ辅助包装载体中CMV启动子驱动下的miR33-5’UTR(SEQ ID NO:1)和miR33-3’UTR(SEQ ID NO:2)之间插入克隆miRNA的位点2x BsmBI，将miRNA表达小片段连接入骨架载体的2xBsmBI位点，并以合成的pA终止子终止转录。

进一步的，所述表达miRNA的载体的构建方法，步骤包括：

(1)、制备线性化粘性末端的克隆用骨架；

(2)、制备双链带粘末端的miRNA表达小片段；

(3)、将(2)中miRNA表达小片段连接至(1)中克隆用骨架上。

进一步的，所述表达miRNA的载体的构建方法，具体步骤包括：