[发明专利]测定人尿液生物样品中的DTPA-Zn的方法

权利要求书

1.测定人尿液生物样品中的DTPA-Zn的方法，该方法使用液相色谱-串联质谱法测定经处理的人尿液生物样品中的DTPA-Zn的含量，包括如下步骤：

(1)生物样品的处理：

(1a)取含有或不含有DTPA-Zn的人尿液50μL，置于1.5mL离心管中，加内标溶液即25μg/mL的EDTA-Zn水溶液20μL或者不加内标溶液，加入0.01％氨水900μL；在不加内标时加入0.01％氨水920μL，使尿液、氨水、任选的内标溶液总体积为970μL；涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上；

(1b)上样后用2mL水清洗，最后用0.5mL含1％氨水的甲醇溶液洗脱；

(1c)收集该洗脱液，吹干，残余物用150μL水复溶，吸取10μL进行LC-MS/MS分析；

(1d)标准曲线的制备：取不同浓度的DTPA-Zn标准系列溶液100μL，置于1.5mL离心管中，加入空白人尿液，涡旋3min，制备相当于浓度为10、20、50、100、200、500、1000和2000μg/mL的尿液样品；取该尿液样品50μL，并依次加入内标溶液20μL、0.01％氨水900μL，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上，接着照以上(1b)和(1c)操作，根据LC-MS/MS分析结果绘制标准曲线，该标准曲线用于计算各种样品中的目标物质含量；

(2)液相色谱-串联质谱测定：

(2a)提供高效液相色谱仪和串联质谱仪，所述高效液相色谱仪配备梯度泵和进样器，所述串联质谱仪配备电喷雾离子源和数据处理系统；

(2b)色谱条件：所用的分析柱为SHISEIDO Proteonavi品牌的色谱柱，其规格为5μm，250×4.6mm I.D.，柱前连接C₁₈保护柱，其规格为4×3.0mm I.D.，流动相为体积比50:50的甲醇-2mM甲酸铵，流动相中含0.03％氨水，流速0.45mL/min；

(2c)质谱条件：电喷雾离子化源，使用Turbo Ionspray源，负离子方式检测；喷射电压为-4000V；源温度为500℃；卷帘气为20；碰撞气为4；扫描方式为多反应监测，用于定量分析的离子反应分别为：DTPA-Zn的m/z 454.2→m/z 364.3+m/z 226.6→m/z 204.5且其CE为45V和乙二胺四乙酸二钠锌盐的m/z 353.0→m/z 263.0且其CE为15V，扫描时间为150msec；

(3)数据处理与分析

(3a)通过上述液相色谱-串联质谱测定得到生物样品中的目标物质含量；和，任选的

(3b)应用美国Winnolin的Phoenix 6.3药代动力学软件对所测数据进行分析，获得与药物暴露相关的选自下列的一个 或多个动力学参数C_max、T_max、AUC_0-t和MRT_0-t。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人尿液是从未给予Zn-DTPA的人获得的尿液作为空白尿液样品，或者是从人给予Zn-DTPA后不同时间获得的尿液作为含药尿液样品。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所获得的人尿液任选的被置于-20℃冰箱中冻存，以等待测定。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所用的内标为EDTA-Zn Na₂·xH₂O。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述固相萃取小柱在上样前，先用1mL甲醇活化，再用1mL水平衡；或者，先用2mL甲醇活化，再用2mL水平衡。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述高效液相色谱仪是美国安捷伦公司Agilent1200型液相色谱仪。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述串联质谱仪是美国AB Sciex公司API 4000型串联质谱仪，其配有Turbo Ionspray离子化源以及Analyst 1.5数据处理系统。