[发明专利]一种动态调控3‑羟基丙酸合成的工程菌构建方法

权利要求书

1.一种动态促进3-羟基丙酸(3HP)高产的工程菌Escherichia coli 3HP-0，其保藏编号为CGMCC No.14224。

2.一种动态促进3HP高产的工程菌株，实验证明具有提高3HP产量的能力。

3.一种动态促进3HP高产的工程菌株，具有缓解丙二酸单酰CoA对菌体毒害的作用。

4.权利要求2所述的动态调控3HP合成的工程菌，其特征在于能根据中间产物丙二酸单酰CoA浓度，同时具有动态调控丙二酸单酰CoA合成的乙酰CoA羧化酶基因(acc)和3HP转化为3HP的丙二酸单酰CoA还原酶基因(mcr)的转录的速率，调控丙二酸单酰CoA合成和转化，缓解丙二酸单酰CoA浓度过高对菌体的毒害，同时提高3HP产量。

5.权利要求2所述的动态调控3HP合成的工程菌，含有大肠杆菌的accDABC基因和lacI基因，橙色绿屈挠菌的mcr基因，含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的转录因子FapR和受FapR调控的启动子控制器(P_FR1)基因序列。

6.一种动态调控3HP合成的工程菌构建方法，其特征在于该方法按照以下步骤进行：

1)纯化扩增出大肠杆菌中的accDA基因和accBC基因，构建得到重组质粒pE7a-acc，通过过表达accDABC基因将初始的乙酰CoA转化为丙二酸单酰CoA；

2)纯化扩增出橙色绿屈挠菌的mcr基因，构建得到重组质粒pS2c-mcr，通过表达mcr将丙二酸单酰CoA转化为终产物3HP；

3)纯化扩增枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的转录因子FapR和受FapR调控的启动子控制器(P_FR1)，同时扩增大肠杆菌中的lacI基因，根据丙二酸单酰CoA调控下游基因转录的含有生物传感器的重组质粒pBFR1k-lacI-FapR，动态调控工程菌株内相关基因的表达，促进3HP的合成；

4)将步骤(1)(2)(3)所构建的三个质粒通过电转化法转入到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，获得阳性转化子；

5)利用步骤(4)所述的阳性转化子过量表达乙酰辅酶A羧化酶和表达丙二酸单酰CoA还原酶，并通过生物传感器动态调控丙二酸单酰CoA浓度，减少过表达acc对细胞的毒害作用，促进3HP生物合成；在含有抗生素抗性培养基的筛选培养后，得到动态促进3HP合成的基因工程菌E.coli 3HP-0，其保藏编号为CGMCC No.14224。