[发明专利]用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合及试剂盒、应用及鉴定方法

权利要求书

1.用于鉴定烤烟秦烟96的引物组合，其特征在于：所述引物针对烤烟秦烟96的12个特异性SNP位点侧翼序列设计，包含这12个SNP位点的基因序列如SEQ ID NO:1~12所示, 所述基因序列SEQ ID NO:1~12的N依次为A、T、C、G、T、C、A、T、T、T、T、A。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于：所述12个特异性SNP位点的引物序列如SEQ ID NO:13~48所示。

3.包含如权利要求1或2所述引物组合的烤烟秦烟96鉴定试剂盒。

4.如权利要求1或2所述引物组合、权利要求3所述试剂盒在烤烟秦烟96品种鉴定方面的应用，其特征在于：包括：取烟草样本基因组DNA进行SNP分型检测，若检测样本中12个SNP位点的基因型与烤烟秦烟96的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟秦烟96；烤烟秦烟96中12个SNP位点的基因型依次为AA、TT、CC、GG、TT、CC、AA、TT、TT、TT、TT、AA。

5.采用如权利要求2所述引物组合鉴定烤烟秦烟96的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）SNP位点多重PCR扩增反应

以烟草样本基因组DNA为模板，利用引物组合中的扩增引物进行多重PCR扩增反应，得PCR产物；

2）SAP酶反应

用SAP酶去除PCR产物中剩余的dNTP和引物，得反应产物；

3）单碱基延伸反应

在反应产物中加入延伸引物进行单碱基延伸反应，得延伸产物；

4）基因型检测及结果判定

对延伸产物进行预处理，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行SNP基因型检测，若检测样本中12个SNP位点的基因型与烤烟秦烟96的完全一致，则判定该烟草样本为烤烟秦烟96；烤烟秦烟96中12个SNP位点的基因型依次为AA、TT、CC、GG、TT、CC、AA、TT、TT、TT、TT、AA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1）中多重PCR扩增反应为：反应体系：10×PCR 缓冲液0.5μL、25mM MgCl₂ 0.4μL、25mM dNTPs 0.1μL、5U/μL PCR Enzyme 0.2μL、1μM扩增引物的混合液1μL、10ng/μL烟草样本基因组DNA 1μL，水补足至5μL；反应条件为：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s、80℃ 5s、5个循环，40个循环；72℃ 3min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2）中SAP酶反应为：在PCR产物中加入1.7U/μL SAP 0.3μL和10×SAP 缓冲液0.17μL，水补足至7μL；反应条件为：37℃ 40min，85℃ 5min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤3）中单碱基延伸反应为：在反应产物中加入10×iPLEX缓冲液0.2μL、10×iPLEX termination mix 0.2μL、33U/μL iPLEXEnzyme 0.041μL和1μM延伸引物的混合液0.94μL，水补足至9μL；反应条件为：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s、80℃ 5s、5个循环，40个循环；72℃ 3min。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤4）中预处理为：在延伸产物中加入水41μL，洁净树脂15mg，混匀后进行脱盐去离子处理，离心取上清液备用；将上清液点样到芯片上，用MALDI-TOF质谱仪扫描芯片，得到SNP基因型检测结果。