[发明专利]一种以薄荷节间茎段为外植体的遗传转化方法

说明书

本发明公开一种以薄荷节间茎段为外植体的遗传转化方法，包括下述步骤：步骤1，农杆菌菌株的活化培养；步骤2，薄荷无菌苗的获得；步骤3，薄荷节间茎段的预培养，步骤4，薄荷节间的遗传转化；步骤5，抗性芽的快速增殖。采用本方法成功实现了薄荷茎段的遗传转化，获得了稳定遗传和快速生长的转基因阳性植株。

本发明具体涉及一种薄荷遗传转化技术邻域，特别公开一种薄荷节间茎段为外植体的遗传转化方法。

背景技术

薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）的茎、叶中富含挥发油，被广泛地应用于食品、医药、化妆品、香料、烟草等工业。薄荷全草入药，用于治疗风热感冒、风温初起、头痛、目赤、喉痹、咽喉肿痛、口舌生疮、牙痛、荨麻疹、风疹等。薄荷是我国重要的香料和药用植物之一，在江苏、安徽、江西等地广为栽培，已成为当地重要的农业特种经济作物。但是在薄荷生产中出现的品种单一、品种退化现象，使薄荷的育种工作越来越引人注目。利用转基因技术培育薄荷优良新品种，具有目的基因来源广，可定向改变目标性状的优点。建立一种高效的遗传转化体系是获得转基因育种成功的关键。目前针对国内薄荷品种的快速繁殖系统主要以带节茎段为再生材料，谢文申等（2016）报道了一种野薄荷脱毒苗的组织快繁方法，快繁外植体为带两叶片的单节茎段，吴涛等（1999）同样报道了以带叶片的单节茎段快繁的方法，但这些方法只适合于薄荷品种的大规模扩繁并不适用于遗传转化方法。因此，为了便于更好的开展国内中药薄荷品种的遗传转化研究，利用基因工程对现有退化薄荷品种进行改良，必须建立一种完善的中药薄荷主栽品种的遗传转化方法。

发明内容

本发明针对传统现有技术的不足之处，提供了一种以薄荷节间茎段为外植体的遗传转化方法，为该植物分子育种方法提供技术支持。

为了达到上述目的，本发明提供了一种以薄荷节间茎段为外植体的遗传转化方法，包括如下步骤：

步骤1，根癌农杆菌菌株的活化培养：将农杆菌在YEB固体培养基上划线后，放在26～30℃的温度条件下进行暗培养24～36h后，挑取单菌落接入YEB液体培养基中，并于25～30℃振荡培养1～2天后，用于外植体浸染；所述的农杆菌为根癌农杆菌LBA4404或EHA105，浸染薄荷节间茎段的菌液OD600＝0 .5～0.8

步骤2，薄荷无菌苗的获得：将薄荷茎尖用75％的酒精消毒20～40s，再用0 .1％升汞消毒5～10min，无菌水冲洗2～5次后，将消毒后的茎尖，剥去最外层2-3片叶子后接种在MS+6-BA 0 .5～2mg·L^-1+NAA0 .1～0.5mg·L^-1+蔗糖20～50g·L^-1+琼脂3 .5～4 .5g·L^-1

的培养基上，并在22～28℃，光强1000～2000lx ,每天光照8～12h的条件下培养，获得薄荷无菌苗。

步骤3，薄荷茎段的预培养：切取薄荷无菌苗第2-4节不带节的节间茎段作为外植体，接种于预培养基上，并进行预培养，预培养基是MS+6-BA 0 .5～2mg•L^-1+NAA0 .1～0.5mg•L^-1+蔗糖20～50g•L^-1+琼脂3 .5～4 .5g•L^-1，薄荷茎段的预培养条件是在18～22℃、无光照条件下进行；