[发明专利]一种高效创建国兰有性多倍体的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物多倍体育种技术领域，具体地涉及一种高效创建国兰有性多倍体的方法。

背景技术

国兰（Chinese Cymbidium）是指兰属植物中一部分产于东亚温带至热带地区的地生种类：包括春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰、春剑、套叶兰、莎叶兰、邱北冬蕙兰、峨嵋春蕙、兔耳兰、宽叶兰、落叶兰等。国兰香气宜人、株型秀美、花色雅致，是中国传统文化的物质载体，素有“花中君子”之称，在我国已有1000多年的栽培历史。随着国兰产业化发展和人们物质文化生活水平的不断提高，国兰开始走进寻常百姓家，受到越来越多消费者的喜爱，其市场前景十分广阔。

多倍体具有植株粗壮、叶片宽厚、花大而艳丽、内含物多、对次生代谢物的积累强以及抗逆性强等优点，还能够克服远缘杂交不亲和，增加物种的多样性，大大的提高了花卉的观赏性和经济价值。多倍体育种是兰花育种的重要方法。目前商业化的大花蕙兰、蝴蝶兰、石斛兰品种大多数都是多倍体品种。但目前产业化生产的国兰品种都是二倍体品种。为了培育国兰多倍体品种，已有研究者通过秋水仙素处理的方法获得墨兰、春兰、寒兰、春剑等无性多倍体的报道。但用秋水仙素诱导产生的多倍体存活率低，生长慢、难繁殖，较难在生产上直接利用。

利用2n配子途径创造多倍体可将植物倍性优势和杂交优势有效结合，快速育成能适应产业化要求、突破性的植物新品种。因此，研究通过2n配子途径创造国兰多倍体，建立高效创建国兰有性多倍体技术体系，对提高我国国兰产业的核心竞争力和效益、尽快缩小我国兰花育种和国外的差距、促进花卉产业高效可持续发展具有十分重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效创建国兰有性多倍体的方法。

一种高效创建国兰有性多倍体的方法，包括以下步骤：

S1. 亲本选择和杂交组合配置：选择高效发生2n配子的杂交兰或国兰做亲本，配置杂交组合，获得果实；

S2. 种子培养和中间繁殖体鉴定：对兰花种子进行无菌培养获得中间繁殖体（一般为根状茎），将单粒种子形成的中间繁殖体进行继代增殖培养，观察中间繁殖体形态、生长速度，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体；

S3. 植株再生和试管苗形态观察：对选到的中间繁殖体进行分化培养和生根壮苗培养，对形成的再生植株进行形态学观察，选择国兰株型、植株粗壮、叶色深、叶厚、根粗壮、根尖端圆钝的植株；

S4. 细胞学鉴定和有性多倍体的获得：对当选的植株进行流式细胞仪测定和根尖染色体数测定，染色体数为60条或以上的为多倍体。

优选地，S1亲本选择中母本为小香，父本为兔耳兰。

进一步地，S2包括以下步骤：

S21. 果实消毒、接种和初代培养：将杂交后150~270天左右的果实洗净，然后用75%乙醇消毒8~10分钟，无菌水冲洗3~5次，取其内部种子接种到固体培养基上培养；培养条件为温度26℃左右，暗培养；

S22. 中间繁殖体的增殖：将种子萌发后形成的中间繁殖体分开，将单个中间繁殖体或将其切成长度2~8mm小段，分别接种于继代培养基上培养；培养条件为温度26℃左右，每日光照8~12小时，光照强度500~1000lux；

S23. 中间繁殖体形态观察：对中间繁殖体的繁殖速度、形态特征进行观察，选择粗壮、尖端圆钝、增殖速度较慢的中间繁殖体。

更进一步地，所述的步骤S21中固体培养基配方1/2MS培养基+0.2～0.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+10～20%（v/v）椰子汁+30g/L糖+0.3～2g/L活性炭+7.5g/L卡拉胶；

所述的步骤S22中固体培养基配方为1/2MS培养基+0.5～2 mg/l 6-BA+0.1～0.2mg/l NAA+0.2～0.5g/L 活性碳+30g/L糖+7.5g/L卡拉胶。

步骤S3中所述植株再生和试管苗形态观察包括如下步骤：

S31. 芽分化培养：将继代培养的中间繁殖体分开，接种于芽分化培养基上培养，培养条件为温度26℃左右，每日光照10小时，光照强度1000~2000lux；

S32. 生根壮苗培养：将高2~4cm从中间繁殖体上切下，接种到生根壮苗培养基上培养，培养条件为温度26℃左右，每日光照10小时，光照强度1000~2000lux；

S33. 试管苗观察：对试管苗及其形成过程进行观察，生长慢、形成过程时间长，粗壮、叶片厚，叶色深、根短粗壮、根尖部圆钝的试管苗为拟似多倍体，以形态正常的植株做对照；