[发明专利]一种抗冻百合及利用抗冻蛋白基因转化百合的方法

权利要求书

1.一种抗冻蛋白基因，其特征在于，所述抗冻蛋白基因为AF1基因，基因序列如SEQ IDNO.3所示。

2.如权利要求1所述的抗冻蛋白基因，其特征在于，所述AF1基因是对极地冻鱼基因AFPIII进行植物密码子优化得到的，极地冻鱼基因AFPIII的序列如SEQ ID NO.4所示，优化后的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种利用权利要求1所述的抗冻蛋白基因转化百合的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1）通过酶切连接的方法将AF1基因插入Pcambia1390骨架载体，并采用PCISV启动子启动，构建AF1基因植物表达载体P1390- PCISV -AF1；

步骤（2）将表达载体P1390- PCISV -AF1电击转化农杆菌菌株，菌落经PCR检测后，载体P1390- PCISV -AF1转化入农杆菌菌株中；

步骤（3）通过农杆菌介导的遗传转化方法将AF1基因转化到受体百合愈伤组织中，经PCR鉴定，确定AF1基因已整合到百合基因组后；将愈伤组织在无抗性培养基上进行生长恢复培养，然后移至分化培养基上培养;侵染条件为培养菌液至OD值为0.2-1.0，侵染时间为5-15min，共培养培养基中AS浓度为10-100 umol/L,得到百合阳性植株。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述Pcambia1390上包含EcoR I/Spe I酶切位点，使用引物对P1390-PCISV-F/R，以PCISV启动子为模板，进行PCR反应，进行Pcambia1390载体与PCISV启动子的酶切连接反应，用变温循环进行酶切连接反应；然后将连接产物热激转化E. coli DH5α感受态细胞，用LB平板筛选抗性质粒，提取质粒，获得中间表达载体P1390-PCISV，使用PCISV启动子特异的引物对PCISV-F/R进行测序验证；

所述PCISV启动子与载体Pcambia1390连接前需要进行改造，使PCISV启动子带有EcoRI、Kpn I、Pml I、Sac I、Xba I和Spe I酶切位点。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，改造过的PCISV启动子下游携带酶切位点及顺序为Kpn I、PmL I、Sac I、Xba I、Spe I，选择Kpn I和Spe I作为候选位点，对合成的AF1基因进行酶切位点改造使其带有Kpn I和Spe I酶切位点，使用引物对P1390-AF1-F/R，以AF1基因为模板，进行PCR实验，然后选用内切酶Kpn I和Spe I，完成P1390-PCISV与AF1基因的连接，进而将连接产物热激转化E. coli DH5α感受态细胞，用LB平板筛选抗性质粒，小量提取质粒，获得AF1基因植物表达载体，以AF1特异的引物对AF1-F/R进行测序验证。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）采用电击法将表达载体P1390-PCISV-AF1转化农杆菌菌株，电转完成的菌液在28~30℃，振荡培养1.5~2.5h，涂平板于YM固体培养基，28~30℃恒温培养箱中培养1d；挑取单菌落于YM液体培养基中，28~30℃振荡培养1.5~2.5h至OD值为0.3-0.6，使用引物对HYG-f/r对潮霉素基因进行菌落PCR扩增。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）使用百合无菌苗的种球鳞片，诱导鳞片切片长出愈伤组织；在灭菌组培瓶中加入含抗生素的YM液体培养基，取步骤（2）得到的农杆菌菌种的菌液，加入到YM液体培养基中，培养至菌液OD在0.2-0.6之间，活化菌种；低温离心弃上清，加入悬浮培养基混匀；将菌液倒入三角瓶中，将百合愈伤切块加入三角瓶中，封口，真空泵中抽真空到0.3~0.5kPa，持续10~20min侵染；共培养基上培养3~5天后转移到筛选培养基上，培养10~20天后将经筛选未死亡的愈伤组织块再次接种到新的筛选培养基上，二次筛选培养20~40天，至收获抗性苗，将抗性苗接入生根培养基中培养。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，侵染条件为培养菌液至OD值为0.2，侵染时间为15min，共培养培养基中AS浓度为100 umol/L，共培养时间为3天。