[发明专利]具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用

说明书

本发明公开ALS突变蛋白，其ALS1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，ALS3氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。本发明还公开编码该突变蛋白的核酸，含有该核酸的表达盒、重组载体或细胞。本发明还公开该突变蛋白、核酸、表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。本发明还公开了获得具有除草剂抗性植物的方法以及抗性植物鉴定方法。本发明是在我国油菜中首次发现的双基因双突变位点的ALS抑制剂类除草剂乙酰乳酸合酶突变体；在田间喷施ALS抑制剂类除草剂苯磺隆和甲基二磺隆实验结果表明，含有本发明的ALS突变蛋白的油菜DS3在3‑4叶期施用16倍的杂草防治推荐使用浓度后，植株仍然正常生长发育和结实。

技术领域

本发明涉及植物抗除草剂和分子育种领域，具体涉及具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用。更具体地，涉及甘蓝型油菜高抗除草剂的乙酰乳酸合酶编码基因的分离、载体构建、培育高抗除草剂植物的方法。

背景技术

油菜(Brassica napus L.)是我国第一大油料作物之一，为我国半数以上的人口提供食用油来源。近年来，随着我国油菜种植方式由传统的劳动密集型向规模化、机械化生产发展，杂草有效防治已成为油菜全程机械化生产、轻简化栽培的重要环节。化学除草是控制农田杂草经济有效手段。遗憾的是，由于缺少商业化的抗除草剂油菜品种，致使当前我国油菜生产化除面积非常有限。北美、欧洲等发达国家早以通过种植抗除草剂油菜实施化学除草。抗除草剂的品种类型主要有孟山都公司的抗草甘膦油菜、拜耳公司的抗草胺膦油菜和巴斯夫公司的抗咪唑啉酮油菜。这些抗性基因受国际知识产权保护，在我国商业化种植需要交纳昂贵的专利费，这将大幅度提高油菜生产成本，违背了种植抗除草剂作物的初衷。同时抗草甘膦油菜和抗草胺膦油菜均为转基因品种，在中国尚未批准商业化种植，无法在生产上应用。而咪唑啉酮类除草剂在土壤中残留期长，仅能在一熟制地区使用，在我国油菜主产区长江流域多熟制地区未能登记发放。因此，创制具有自主知识产权、适合我国生产需求的抗除草剂油菜新种质、挖掘抗性基因对油菜抗除草剂品种选育均具有十分重要的现实意义。

乙酰乳酸合酶(Acetolactate synthase，ALS)，也叫乙酰羟基酸合酶(Acetohydroxyacid synthase,AHAS)，是植物和微生物3种支链氨基酸生物合成过程中的关键酶(McCourt JA,Duggleby RG.Amino Acids,2006,31:173–210)。如果此酶的活力受到抑制或者丧失，会导致植物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成受阻，影响蛋白质合成，最终导致植物生长受阻、直至死亡，因此以ALS为作用靶标开发了多种类型的高效除草剂，如磺酰脲类(sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮类(imidazolinones，IMI)等。这些除草剂统称为ALS抑制剂类除草剂或ALS类除草剂，具有选择性强、杀草谱广、使用剂量低、对哺乳动物毒性小等优点，在生产上得到广泛应用，已成为继草甘膦后的第2大类除草剂。然而，商业化的ALS类除草剂对双子叶作物油菜具有强烈的生长抑制作用，使其仅能在水稻、小麦、玉米等单子叶作物中应用。为此，培育抗性油菜品种，拓宽现有ALS类除草剂的应用范围，可有效解决这一难题。但是，由于缺少生具有产应用价值的抗性种质或基因，国内至今还没有培育出商业化的抗性油菜品种。