[发明专利]植物内生细菌多样性16SrDNA扩增子制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物多样性高通量测序技术领域，尤其涉及植物内生细菌多样性的研究。

背景技术

植物内生细菌(Endophytic bacteria)是能够定殖于健康植物细胞间隙或者细胞内，并与宿主植物建立起和谐联合关系的一类微生物。它们可以为植物提供矿物质营养，也可以间接保护植物不受病原菌的侵害。但是在进行植物内生细菌的研究过程中，内生细菌的分离鉴定一般比较困难。集合16S rDNA特异片段PCR扩增与第二代高通量测序技术进行植物内生细菌的鉴定是近年来比较流行的一种方法，但是提取的总DNA中含有大量的宿主DNA，包括大量的线粒体DNA和叶绿体DNA等，给细菌16S rDNA的扩增子的制备造成了极大的干扰。使用传统的引物如338F/806R、515F/907R等无法将细菌16S rDNA与宿主线粒体或者叶绿体DNA在高通量测序前进行有效的分离，往往导致测序结果中存在大量的植物宿主序列。发明人在使用引物338F/806R、515F/907R进行植物内生细菌16S rDNA测序时发现，在测序数据中宿主的占比高达59.4％～92.8％。高的宿主数据占比将会严重浪费测序数据量，影响对植物内生细菌多样性的分析。在内生细菌相关的研究中为了获得一定数据量的微生物数据，通常需要增加测序的通量，这也就意味着研究成本将大大增加。

文献[1]中披露了使用引物799F/1492R扩增植物内生细菌16S rDNA V5～V8区，可以有效减少宿主叶绿体DNA的扩增，同时该引物扩增宿主线粒体DNA与细菌16S rDNA的产物大小存在明显的差异。文献[2]披露了使用引物799F/1392R也可以实现对宿主叶绿体DNA扩增的有效减少以及线粒体DNA与细菌16S rDNA扩增子的显著区分。基于文献[3]中的方法，本发明人在SILVA SSU 128RefNR数据库中应用TestPrimer工具测试引物799F/1492R和799F/1392R对细菌的覆盖度，结果发现，在序列完全匹配(0mismatch)时，引物799F/1492R和799F/1392R对细菌的覆盖度分别为29.2％和69.8％。所述799F的序列为SEQ ID NO：1，所述1492R的序列为SEQ ID NO：3，所述1392R的序列为SEQ ID NO：2。但是无论是引物799F/1492R还是引物799F/1392R，其扩增的细菌16S rDNA扩增子均大于600bp，在以往的研究中主要基于454测序平台进行测序。然而，由于Roche(罗氏)公司不再生产用于454测序平台的试剂，导致该平台已于2016年退出市场。目前在二代测序市场中，Illumina公司的MiSeq测序平台的测序读长最长，可达300bp。但，即使使用MiSeq测序平台的2×300测序模式进行测序，在16S rDNA扩增子测序项目的研究中也无法组装出如此长(≥600bp)的DNA片段。

许多研究显示使用引物799F/1193R也可以有效减少宿主叶绿体DNA的扩增，同时实现线粒体DNA与细菌16S rDNA扩增子的分离，其中扩增线粒体DNA的片段大小约为600bp，细菌16S rDNA扩增子的大小约为400bp， 其目的扩增片段长度可适用于目前的二代测序平台(参考文献[4]和文献[5]和文献[6])。但是本发明人在使用该引物进行植物内生细菌多样性16S rDNA测序研究时发现宿主叶绿体数据占比仍然较高，参考表1。

参考文献:

[1].Chelius M K,Triplett E W.The Diversity of Archaea and Bacteria in Association with the Roots of Zea mays L[J].Microbial ecology,2001,41(3):252-263.

[2].Bai Y,Müller D B,Srinivas G,et al.Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota[J].Nature,2015,528(7582):364-9.

[3].Quast C,Pruesse E,Yilmaz P,et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project:improved data processing and web-based tools[J].Nucleic acids research,2013,41:590-596.