[发明专利]一种增强凝血酶核酸适配体亲和力的方法

说明书

本发明公开了一种增强凝血酶核酸适配体亲和力的方法。本发明提供了一种提高α凝血酶的核酸适配体Apt15亲和力的方法，包括如下步骤：在凝血酶核酸适配体Apt15的3’末端延长大于等于18个T，得到α凝血酶的DNA核酸适配体，实现提高α凝血酶的核酸适配体Apt15亲和力。Apt15可以与人α凝血酶的纤维蛋白原位点特异性结合，在特异检测人α凝血酶有优势，这种末端增加了T核苷酸的具有高亲和力的适配体更有利于相应的核酸适配体在分析传感、疾病治疗诊断等领域的应用,在相关应用领域显示出应用潜力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种增强凝血酶核酸适配体亲和力的方法。

背景技术

核酸适配体(Aptamer)是从随机序列的寡聚核酸文库中筛选得到的能够与目标分子高亲和力和高选择性结合的单链核酸分子。与免疫抗体相比，核酸适配体显示出诸多优点，如筛选制备无需动物，可以通过化学方法合成、容易引入修饰基团用于标记和固定化等。核酸适配体在分析传感、疾病诊断治疗、药物开发等方面都显示出潜力。凝血酶是血液中的一种重要蛋白酶负责血液的凝固等，同时也是一些疾病的标志物。1992年研究者报道了一种可与人α凝血酶(humanα-thrombin)特异结合的含15个核苷酸的DNA适配体(5’-GGTTGG TGT GGT TGG-3’,这里简称为Apt15)(L.C.Bock,L.C.Griffin,J.A Latham,E.H.Vermaas,J.J.Toole,Selection of single-stranded DNA molecules that bindand inhibit human thrombin,Nature 1992，355，564-566)，它的解离常数K_d约为100nM,可与凝血酶表面的纤维蛋白原结合位点作用。Apt15较低的亲和力限制了Apt15在分析传感等领域的应用。具有高亲和力的核酸适配体在应用中显示出优势。发展一种可增强已有核酸适配体序列的亲和力的方法，将有助于改善适配体的亲和性能，有利于其应用。

发明内容

本发明的1个目的是提供一种提高α凝血酶的核酸适配体Apt15亲和力的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：在α凝血酶核酸适配体Apt15的3’末端延长大于等于18个T，得到α凝血酶的DNA核酸适配体，实现提高α凝血酶的核酸适配体Apt15亲和力。

所述凝血酶核酸适配体Apt15的核苷酸序列为序列11，即为5’-GGT TGG TGT GGTTGG-3’。

上述方法中，所述在凝血酶核酸适配体Apt15的3’末端延长大于等于18个T为在凝血酶核酸适配体Apt15的3’末端延长大于等于18个T且小于等于35个T；

或所述在凝血酶核酸适配体Apt15的3’末端延长大于等于18个T为在凝血酶核酸适配体Apt15的3’末端延长18、19、20、21、22、23、24、25、30或35个T；

或，所述提高α凝血酶的核酸适配体Apt15亲和力体现在所述α凝血酶的DNA核酸适配体的亲和力大于所述核酸适配体Apt15的亲和力。

在Apt15的3’端增加具有若干长度的聚胸腺嘧啶(T)核苷酸(polyT)，发现增加的polyT长度大于等于18个T后，核酸适配体的亲和力明显增强。利用这种在Apt15的3’端带有polyT的高亲和力适配体，在核酸适配体亲和毛细管电泳分析法中能形成稳定的凝血酶-核酸适配体复合物，可以和未结合的适配体探针很好地分离开，进而实现对人α凝血酶的灵敏检测。

本发明另一个目的是提供一种α凝血酶的DNA核酸适配体。

本发明提供的α凝血酶的DNA核酸适配体，为在凝血酶核酸适配体Apt15的3’末端延长大于等于18个T，得到α凝血酶的DNA核酸适配体。