[发明专利]一种高效提取微生物群体感应信号分子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效提取微生物群体感应信号分子的方法，属于废水生物处理领域。

背景技术

群体感应是微生物细胞间主要的信息传递方式，微生物根据自身种群密度、环境因子变化分泌一种或多种信号分子，通过扩散、转运蛋白作用进入细胞并结合特异蛋白，进而调控下游功能基因表达实现生物膜形成、致病因子分泌、生物荧光等生命活动。信号分子主要分为三类，分别为作用于革兰氏阴性菌之间的N-酰基高丝氨酸内酯(Acyl-Homoserine Lactone,AHL)、作用于革兰氏阳性菌之间的多肽类物质和同时作用于革兰氏阳性菌和阴性菌之间的AI-2物质(4,5-二羟基-2,3-二戊酮为前体物质，发生重排和自发反应形成)，这三类信号分子能产生作用，都必须满足一下三个条件：1○信号分子达到临界浓度；2○信号分子合成酶高活性；3○信号分子的受体蛋白浓度高。好氧颗粒污泥作为生物膜的特殊存在形式，其功能菌群多数为革兰氏阴性菌，因此AHL类信号分子对颗粒污泥形成和体系稳定运行有重要调节作用，在好氧颗粒污泥领域研究最广泛。目前多利用感应微生物、薄层层析法、HPLC-MS/MS等方法对体系AHL进行定性、半定量、定量分析。多数关于好氧颗粒污泥体系微生物群体感应的研究表明，AHL主要通过影响EPS的组成和分泌来影响好氧颗粒污泥的形态和生理特征。

但是目前好氧颗粒污泥体系AHL含量基本处于ppb-ppt数量级，难以满足定量、定性分析所要求的检出限，因此有必要通过浓缩的方式提高溶液中AHL含量以达到检测要求。目前应用于好氧颗粒污泥反应器出水AHL浓缩的方法多为取大量出水，液液萃取后经减压蒸馏定容至所需体积，但对于小体积出水和AHL含量较低的体系为达到更高浓缩比例，很难利用微量溶剂将减压蒸馏后的产物充分溶解，导致萃取效率偏低。因此，研发高效的AHL萃取浓缩方法，以满足小体积出水和AHL含量较低的体系的浓缩要求，是研究好氧颗粒污泥体系的群体感应调控机制的重要前提。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效提取微生物群体感应信号分子的方法，在传统AHL浓缩的基础上增加氮吹定容步骤，以满足小体积出水和AHL含量较低的体系的浓缩要求。

高效提取微生物群体感应信号分子的方法，主要包括以下步骤，(1)反应器出水收集和过滤；(2)液液萃取；(3)减压浓缩；(4)氮吹定容：该方法将反应器出水经0.45μm玻璃纤维滤膜过滤，然后与二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂按一定体积比混合，使信号分子从水相转移到有机相中，实现信号分子初步富集，萃取后的溶液在一定温度和压力条件下通过旋转蒸发仪减压蒸馏，实现信号分子的初步浓缩，减压蒸馏所用蒸发瓶经相应有机溶剂充分洗涤后与蒸馏剩余溶液经氮吹吹干，并根据测试条件利用相应有机溶剂对氮吹后的固体定容，实现信号分子的高效富集。

本发明具体采用的技术方案如下：

高效提取微生物群体感应信号分子的方法，包括以下步骤：

步骤1：收集SBR反应器运行周期中出水阶段的全部泥水混合物，经过沉淀后再通过装有0.45μm玻璃纤维滤膜的玻璃砂芯滤器过滤；

步骤2：取经过过滤的液体并置于梨形分液漏斗中，加入有机溶剂作为萃取剂，利用分液漏斗振荡器进行振荡，萃取重复若干次，收集有机相；

步骤3：通过旋转蒸发仪连续进料口将收集的有机相吸入蒸发瓶中至有机相蒸干，取萃取剂充分洗涤蒸发瓶若干次，洗涤液体收集至离心管中；

步骤4：将所述离心管置于氮吹仪上，氮吹过程中不断调节氮吹针高度，使离心管内液面处于震动状态，直至离心管内液体吹干；然后利用溶剂对氮吹后的固体进行定容，完成SBR反应器出水中群体感应信号分子的提取和富集。

基于上述方案，各步骤中的参数以及材料可以采用如下优选方案：

作为优选，所述的步骤1中泥水混合物预先经过1-2min沉淀后再装入玻璃砂芯滤器中进行过滤。

作为优选，所述的步骤2中所述的有机溶剂包括二氯甲烷、三氯甲烷或乙酸乙酯。

作为优选，所述的步骤2中离心上清液与有机溶剂的混合体积比为1:(1-2)。

作为优选，所述的步骤2每次萃取过程中，分液漏斗振荡器以200-300rpm振荡5-10min，萃取重复2-5次。

作为优选，所述的步骤3中，旋转蒸发仪的减压蒸馏温度为30-40℃，压力为500-800mbar。

作为优选，所述的步骤4的氮吹过程中，氮气流量控制在1.0-3.0L/min。

本发明的有益效果：