[发明专利]SPNP‑I在制备Nav1.3通道工具试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种活性多肽在制备离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I（简写为SPNP-I）在制备电压门控钠通道工具试剂-Nav1.3型钠通道抑制剂中的用途。

背景技术

电压门控钠通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钠通道在动作电位的产生和传播过程中的关键性作用，电压门控钠通道成为很多动植物毒素的作用靶标。钠离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。电压门控钠通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。迄今为止，从多种动物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋动物等）的毒液中鉴定到了很多作用于钠通道的活性成分。它们通过与钠通道的不同位置相结合从而引起通道的动力学特征发生相应的变化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延缓等。通过阐述这些特异性调制剂作用于钠通道的分子机制，除了在理论上可深入推测钠通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。

发明内容

本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I在制备电压门控钠通道工具试剂-Nav1.3型钠通道抑制剂中的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I（简写为SPNP-I），其氨基酸序列为：

NH₂-Ala Cys Gly Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Glu Gly Lys Pro Pro Cys Cys Ala Asn Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile Trp Ser Pro-OH,

其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I作为单一有效活性组份用于制备Nav1.3型钠通道抑制剂。

所述的一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I在制备电压门控钠通道工具试剂-Nav1.3型钠通道抑制剂中的应用，其特征在于，所述的蜘蛛抑钠肽-I的N端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，N端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

该蜘蛛抑钠肽-I作为单一有效活性组分用于制备Nav1.3型钠通道抑制剂，以细胞外给药的方式制备成Nav1.3型钠通道工具试剂。

蜘蛛抑钠肽-I在制备Nav1.3型钠通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为1 μmol/L。

蜘蛛抑钠肽-I对Nav1.3型钠通道的抑制呈现浓度依赖性和时间依从性，是一种较好的Nav1.3型钠通道工具试剂。

附图说明

图1是SPNP-I对Nav1.3型钠通道的影响。

图2是SPNP-I抑制Nav1.3型钠通道的时间-效应关系曲线。

具体实施方式

为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过细胞外给药途径，采用转染HEK293T细胞模型来说明蜘蛛抑钠肽-I的Nav1.3型钠通道抑制作用。

1、实验材料和方法

1.1人胚肾细胞（HEK293T）的培养及转染

HEK293T细胞适应酸性环境,pH 值在 6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长,换液时动作要轻。一般用高糖的DMEM培养基。

1.1.1细胞的传代培养

(1) HEK293 细胞传代时机为达80-90%汇合，待细胞在60mm培养皿中长满后，吸掉培养液。

(2) 加适量PBS漂洗两次，吸掉。

(3) 加0.5mL 0.25%胰酶，摇匀。37℃培养箱中胰酶处理2-3min。于显微镜下观察细胞是否全部脱壁。加入适量10% 新生牛血清DMEM培养液终止胰酶反应。

(4) 用移液管将细胞团轻轻吸打成单个细胞。将细胞按1∶3平均分入装有预热培养液的培养皿中，于37℃、5% CO₂、15%相对湿度培养箱中培养。

1.1.2阳离子性的脂质体法转染方法: