[发明专利]SPNP‑I在制备Kv2.1钾通道工具试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种活性多肽在离子通道工具试剂中的用途，尤其是用化学法制备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I（简写为SPNP-I）在制备电压门控钾通道工具试剂-Kv2.1型钾通道抑制剂中的用途。

背景技术

电压门控钾通道广泛分布于神经元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可兴奋性组织中，是一种重要的跨膜结构蛋白，其参与调节神经递质的分泌、血管收缩、胰腺分泌和骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。钾通道在动作电位的产生和传播过程中的关键性作用，电压门控钾通道成为很多动植物毒素的作用靶标。钾离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。电压门控钾通道很可能成为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。自然界的动物毒素是一类具有很高实用价值和应用前景的工具试剂或药物导向物质，不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器，也是从事神经生物学和生理学研究、天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研究离子通道的独特“分子探针和解密器”。迄今为止，从多种动物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋动物等）的毒液中鉴定到了很多作用于钾通道的活性成分。它们通过与钾通道的不同位置相结合从而引起通道的动力学特征发生相应的变化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延缓等。通过阐述这些特异性调制剂作用于钾通道的分子机制，除了在理论上可深入推测钾通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外，还可以为将它们开发成治疗人类相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。

发明内容

本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I在制备电压门控钾通道工具试剂-Kv2.1型钾通道抑制剂中的应用，所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I（简写为SPNP-I），其氨基酸序列为：

NH₂-Ala Cys Gly Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Glu Gly Lys Pro Pro Cys Cys Ala Asn Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile Trp Ser Pro-OH

其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I作为单一有效活性组份用于制备Kv2.1型钾通道抑制剂。

蜘蛛抑钠肽-I作为单一有效活性组分用于制备Kv2.1型钾通道抑制剂。

蜘蛛抑钠肽-I制备成细胞外给药的Kv2.1型钾通道工具试剂。

蜘蛛抑钠肽-I在制备Kv2.1型钾通道工具试剂或抑制剂时，配制细胞外给药的剂量为10 µmol/L。

蜘蛛抑钠肽-I 对Kv2.1型钾通道的作用具有浓度依赖性，半数有效作用剂量IC₅₀为8.05 µmol/L。

蜘蛛抑钠肽-I对Kv2.1型钾通道的作用是时间依从的。

附图说明

图1是10 µmol/L SPNP-I对Kv2.1型钾通道的影响。

图2是SPNP-I作用于Kv2.1钾通道的浓度-效应关系曲线。

具体实施方式

为了更好的理解和更充分公开本发明，下面将通过细胞外给药途径，采用爪蟾卵母细胞模型来说明蜘蛛抑钠肽-I的Kv2.1型钾通道抑制作用。

1、实验材料和方法

1.1质粒的线性化及回收

cDNA的回收操作如下：取Kv2.1质粒 20µL,10×Buffer 5µL,H₂O 22µl，限制性内切酶NotI 3µl,震荡混合后，37℃下放置5hr。 酶切后的产物用0.8%的Agarose胶电泳，切胶后用离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。割下含DNA的Agarose胶放入1.5 mL离心管中，每100 mg胶加入300µl溶胶液，置65℃水浴10min,使胶完全溶化,混合液转入到已经套入收集管的吸附柱内,13000 rpm离心30s,倒掉废液,加入700µl漂洗液, 13000 rpm离心30s,倒掉废液,加入500µl漂洗液, 13000 rpm离心30s,倒掉废液,13000rpm空柱离心2min,尽量除去漂洗液。将吸附柱放入一干净离心管中,加入适量经65-70℃水浴预热的洗脱缓冲液,室温放置2min，13000 rpm离心1min收集DNA溶液。

1.2 cDNA的体外转录和mRNA的纯化