[发明专利]一种固相萃取材料及其在核酸的富集与检测中的应用

说明书

本发明涉及分析化学与生物检测技术领域，尤其涉及一种固相萃取材料及其在核酸的富集与检测中的应用。本发明提供的是由rGO或GO修饰的固相萃取材料，GO或rGO修饰的材料能够通过静电作用力，氢键和π‑π作用力快速有效地吸附核酸，特别是短单链核酸，从而降低了对核酸样品的检测限，提高了检测的灵敏度。

技术领域

本发明涉及分析化学与生物检测技术领域，尤其涉及一种固相萃取材料及其在核酸的富集与检测中的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，主要参与转录后基因表达的调控，其能够和目的mRNA的结合使目的基因沉默或者降低表达，从而起到调控机体的作用。因miRNA的含量变化往往和癌症的发生有着密切的关系，故而对其检测是众多核酸检测领域中重要的一个环节。目前常用的miRNA的检测手段主要为poly(A)加尾RT-PCR和茎环引物RT-PCR等。前者无法区分样品制备过程中夹杂的pri-miRNA或pre-miRNA，所以无法对miRNA进行准确的定量分析。后者通常不会和pre-miRNA发生退火，但是引物设计难度大，茎环形成的条件较为苛刻。近年来，科学工作者发展出了多种miRNA检测的新技术，其中滚环扩增(RCA)被广泛地应用在miRNA的检测当中。miRNA为短单链RNA，和RCA的检测目标(短单链核酸)相匹配。在环形探针的存在下，miRNA和其一部分互补配对，在Bst酶或phi29酶的作用下完成恒温扩增。但是常规的RCA无法区分同源miRNA，即只有一个或两个碱基差异的miRNA。

石墨烯是由碳原子以sp2杂化轨道组成六角型呈蜂巢状的单原子层的二维晶体。目前根据相关文献报道，氧化石墨烯(GO)或还原氧化石墨烯(rGO)由于富含π电子云和含氧基团，能够过π-π相互作用，氢键和静电作用快速地使短单链核酸吸附在石墨烯表面，而对长链核酸和双链核酸的吸附能力和吸附速率较弱，并且rGO或GO能够猝灭靠近其的荧光基团。固相萃取技术是分析化学中的样品预处理技术，该技术可以对样品进行富集，可以大大提高检测的灵敏度。但是目前仅见报道称，反应体系中高浓度的rGO或GO会抑制RCA反应，尚没有文献或专利报道将石墨烯能吸附短单链核酸的性质和固相萃取技术结合用于miRNA的富集及扩增上。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种固相萃取材料及其在核酸的富集与检测中的应用，本发明提供的固相萃取材料表面负载有氧化石墨烯(GO)或还原氧化石墨烯(rGO)，以其对miRNA进行萃取和富集，使得RCA对miRNA的检出限提高，有利于痕量miRNA的检测。并且由于rGO的使用，使得RCA对同源miRNA的区分能力大大增强。

本发明提供的固相萃取材料，其固相基底表面修饰氧化石墨烯或还原氧化石墨烯。

本发明中，所述固相基底为玻璃珠或磁珠。玻璃珠的直径影响其比表面积，进而影响吸附的效率，本发明中，所述玻璃珠直径为100μm～300μm。一些具体实施例中，所述玻璃珠的直径为200μm。所述磁珠的直径为10nm～5μm。

本发明实施例中，所述固相萃取材料为表面修饰氧化石墨烯的玻璃珠；表面修饰还原氧化石墨烯的玻璃珠；表面修饰氧化石墨烯的磁珠或表面修饰还原氧化石墨烯的磁珠。

本发明提供的固相萃取材料由带有正电荷的固相基底吸附氧化石墨烯或还原氧化石墨烯制成。GO或rGO在玻璃珠表面形成薄膜，或者GO或rGO的表面与球形磁珠结合，从而使制得的固相萃取材料能够吸附核酸。其中，以磁珠作为固相基底时，磁珠结合在石墨烯表面的负电基团附近，使平面的石墨烯表面结合一个或多个磁珠。

GO和rGO修饰的固相萃取材料通过静电作用力和氢键，π-π作用力对核酸进行吸附，且相比于双链核酸和长单链核酸，其对短单链核酸(例如ssDNA或miRNA)的吸附能力和吸附速率速率更快而且和GO相比，rGO吸附短单链核酸的能力更强。本发明提供的固相萃取材料的制备方法，为将氧化石墨烯或还原氧化石墨烯的分散液与固相基底混合、吸附，制得固相萃取材料；所述固相基底为玻璃珠或磁珠。