[发明专利]一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用，通过斯氏副柔线虫转录组测序，预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析，找出斯氏副柔线虫特有基因，用RT‑PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPR，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30a中，转化至E.coli BL21，进行诱导表达，用Western‑bloting法验证重组蛋白rCPR的免疫原性。斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因重组蛋白经纯化后，建立了家畜斯氏副柔线虫iELISA检测方法。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用。

背景技术

斯氏副柔线虫病由斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)寄生于骆驼、羊、牛等反刍动物真胃引起,尤以骆驼感染较为严重。大量虫体寄生可导致患畜真胃发生炎症、出血、溃疡,严重者造成骆驼死亡,对养驼业危害极大，是危害我国养驼业的一种主要寄生虫病，长期以来,给农牧民带来了巨大的经济损失。因此，今后对斯氏副柔线虫病的监测和防制是骆驼寄生虫病防治中的重点。

由于骆驼多分布在第三世界国家的落后地区，所以时至今日，国内外关于斯氏副柔线虫病的研究报道较少。严重危害我国骆驼养殖业的斯氏副柔线虫病的相关研究滞后，在骆驼斯氏副柔线虫病的防治上，目前存在的主要问题是缺少针对该病的基础理论研究、缺乏有效的生前诊断方法和防治的新方法。适用于许多寄生性线虫的粪便虫卵检查法用于该病的诊断，检出率非常低，很难用于临床实践。该病的诊断主要依靠死后剖检(在真胃查找虫体)，此类诊断方法不能为早期治疗提供参考。在实际的生产中，往往是在没有诊断依据的情况下盲目地给药驱虫，造成经济损失的同时也带来了诸如毒副作用、出现耐药虫株和畜产品兽药残留超标等诸多弊端。

当前，在生产实践中亟待研究斯氏副柔线虫病的生前诊断方法，为该病的防治提供科学依据，使该病的防治更有针对性，提高防治效果，避免不必要的经济投入，同时为该病的监测提供科学的监测手段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种重组斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶的制备方法及应用。该方法通过斯氏副柔线虫转录组测序预测出的编码基因与已公布的线虫数据库比对分析，找出斯氏副柔线虫特有基因并进行功能注释，用RT-PCR方法从斯氏副柔线虫中扩增出特有基因Pj_CPR，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30a中，转化至E.coli BL21(DE3)，进行诱导表达，用western-bloting法验证Pj_CPR重组蛋白的免疫原性。

其具体技术方案为：

斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

用于扩增权利要求1所述斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的特异性PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。

斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj_CPR基因的克隆、原核表达方法，包括以下步骤：

步骤1、引物设计

根据Pj_CPR的基因序列，用Oligo6.0设计引物，分别在上游引物和下游引物中插入限制性内切酶EcoR I、Xho I酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成。

步骤2、斯氏副柔线虫总RNA的提取

按照TaKaRa RNAiso Plus RNA提取试剂说明书提取斯氏副柔线虫总RNA，具体步骤如下：