[发明专利]膀胱癌组织T细胞图谱模型及其构建方法和构建系统

权利要求书

1.一种膀胱癌组织T细胞图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

设置疾病组与对照组，其中，疾病组取离体的膀胱癌患者膀胱癌组织的标本待用，对照组取离体的膀胱癌患者膀胱癌旁组织的标本待用；

提取各标本的全基因组DNA；

扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库；

采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序；

对测序结果进行分析，构建膀胱癌组织T细胞图谱模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述提取各标本的全基因组DNA，具体包括：

(1)将各标本粉碎成碎片，分别取25mg各标本碎片放入至1.5ml的离心管中，加入180μLbuffer ATL；

(2)加入2μL的蛋白酶K，充分涡旋混合均匀，在56℃孵育直至各标本碎片溶解，在各标本碎片溶解的过程中不断涡旋使组织充分散开；

(3)加入200μL Buffer AL，涡旋混匀15s，56℃孵育10min直至溶解；

(4)加入200μL无水乙醇，涡旋混匀15s，得到混合液；

(5)将所述混合液加入吸附柱，然后将吸附柱放入收集管中，≥8000rpm离心1min，弃滤液；

(6)加入500μL Buffer AW1，≥8000rpm离心1min，弃滤液；

(7)加入500μL Buffer AW2，14000rpm离心3min，弃滤液；

(8)把吸附柱放到一个新的1.5mL收集管内，加入30μL Buffer AE至膜中间，室温放置1min，14000rpm离心1min；使用30μL洗脱液Buffer AE重复此步骤；

(9)收集DNA并存放在2℃～8℃冰箱中待用，即得到各标本的全基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在提取各标本的全基因组DNA之后，以及在扩增出TCR的CDR3区之前，所述构建方法还包括：

检测全基因组DNA中DNA含量及完整性，检测是否合格，是则执行下一步骤。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，采用荧光定量测定全基因组DNA中DNA含量。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，采用琼脂糖凝胶电泳检测全基因组DNA中的完整性。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库具体包括：

取各标本的全基因组DNA；

加入引物；

进行多重PCR扩增；

进行电泳检测回收100bp～190bp的多重PCR产物；

进行末端修复反应，并对产物进行纯化；

配制接头连接反应体系对进行末端修复反应后的产物进行接头连接；

通过PCR反应富集经过接头修饰的DNA片段；

纯化，分别得到疾病组文库和对照组文库。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述扩增出TCR的CDR3区，分别得到疾病组文库和对照组文库之后，以及在采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序之前，所述构建方法还包括：

分别对所述疾病组文库和所述对照组文库进行片段范围检测和浓度定量。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用高通量测序技术，对所述疾病组文库和所述对照组文库进行测序，具体包括：

稀释各文库并使各文库中的DNA变性；

按照预期上机数据量，稀释；并将变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交；

在簇生成平台cBot上结合TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS试剂完成桥式PCR扩增；

将制备好的FlowCell采用Illumina MiSeq测序系统和TruSeq SBS KIT-HS v3试剂进行上机测序。