[发明专利]一种新型新生儿败血症快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学检测领域，具体涉及一种新型新生儿败血检快速检测试剂盒。

背景技术

新生儿败血症是新生儿常见疾病之一，指新生儿期致病菌经各种途径侵入其血循环系统，并在其中生长繁殖、产生毒素，最终造成全身性的炎症反应。该病的病因较复杂，常见致病菌有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄菌、克雷白杆菌及B组链球菌等，主要通过宫内感染、产时感染及产后感染。新生儿败血症是新生儿常见的全身性疑团莫释感染疾病。

新生儿时期该病的发生率和病死率均较高，常常会危及到新生儿的生命，严重者可并发化脓性脑膜炎并遗留中枢神经系统后遗症，但因缺乏典型的临床表现和体征，往往病情进展迅速，严重威胁新生儿的生命。由新生儿败血症引起的指新生儿期病原菌进入血液循环系统并进行繁殖释放毒素进而导致全身性感染，是导致新生儿死亡的重要原因之一，其发生率为0。1％至1.0％，在早产儿中发生率更高，病死率高达10％至50％，因此做好早期诊断具有重要意义。

目前，临床上的血培养检测细菌常用方法由于检测时间长，且阳性率较低，难以达到早期诊断的目的。例如，作为目前新生儿败血症有主要诊断手断的细菌培养，受细菌培养周期的影响，其相关诊断结果需要在培养后72小时以后才可以获得。即便如此，由于一些相关细菌分离存在一定的困难，使得结果出现一定概率的假阴性，相关报告表明在确诊的新生儿中有30％-40％的患儿血液培养时出现了假阴性情况。而临床常用的其它非特异性指标也存在着一定的问题，例如CRP在感染后24小时左右才会出现升高的情况，而出生体重较低的婴儿反应更慢，白细胞计数等指标在诊断新生儿败症明缺乏敏感性与特异性。

对于新生儿败血症的检测与诊断，传统的诊断方法存在的固有的缺点，例如操作周期长，灵敏度低等。因此有必要建立一个快速、准确的诊断方法，确保新生儿败血症检测与诊断进行快速诊断

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新型新生儿败血症快速检测试剂盒，其目的在于对新生儿败血症进行快速检测，起到早其诊断的目的，可用于临床可疑感染患者的病原鉴别与诊断。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案实现：通过一种荧光PCR引物、探针及试剂盒的制备对疑似患有新生儿败血症的患儿的血样进行分析、检测，进而起到快速诊断新生儿败血症的目的。

为实现上述目的，本发明提供一种检测用引物及探针对新生儿败血症进行检测。

进一步，本发明提供的用于检测新生儿败血症的引物序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.2

进一步，本发明提供的用于检测新生儿败血症的所述探革兰阳性菌及阴性菌探针，所述序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，探针的5’端分别连接不同的报告基团，3’端连接非发光的猝灭基团：

优选的，所述报告基团为FAM,TET,JOE或HEX其中一种，淬灭基团为TAMRA或BHQ1其中一种，所述检测体系中还加有RT-PCR MIX及超纯水。所述试剂盒还含有RT-PCR酶及阳性对照品。

优选的，所述阳性对照品以革兰阳性菌和革兰阴性菌的目的基因片断进行PCR扩增并将扩增的目的电泳条带回收，连接到克隆质粒载体，测序筛选阳性克隆，并以阳性重组质粒做为阳性对照品，革兰阳性菌上下游引物引物序列分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，革兰阴性菌的上下游引物序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8。

优选的，本发明，通过紫外分光光度计测定质粒浓度，并将其最终稀释到10⁸copies/μL。

优选的，本发明，阴性对照管包含高温压灭的焦碳酸二乙脂处理水。

优选的，本发明，试剂盒检测体系为：荧光检测体系混合液10μL， RT-PCR酶3.5μL，待测样品5μL。荧光检测体系混合液包括引物和荧光探针，其中引物浓度为100-1000nM，探针浓度为50-500nM。

优选的，本发明所述待测样品为样本核酸提取液体及阳性对照品。

本发明的PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s；60℃1min,40个循环。

本发明样本核酸提取液来自新生儿血液。

本发明提供的荧光宣试剂盒需保存于-20℃条件下，荧光检测体系混合液需避光保存。

本发明的优点在于快速检测新生儿败血症。本试剂盒法灵敏度高、特异性好，能够检测到最低浓度为10copies/μL数量级的阳性标准品，能够特异性识别新生儿败血症并对细菌进行分型。

附图说明