[发明专利]一种经黄芪提取物FQR‑8诱导的DC‑CIK细胞的高效活性保存方法

权利要求书

1.一种经黄芪提取物FQR-8诱导的DC-CIK细胞的高效活性保存方法，包括如下步骤：用冻存液悬浮DC-CIK细胞，配制成DC-CIK细胞悬浮液，然后对细胞悬浮液进行冻存，

其中，冻存过程：将细胞悬浮液4℃放置30min，零下20℃放置2h，零下40℃放置1h，零下80℃放置过夜，迅速转入液氮中冻存。

2.权利要求1所述的保存方法，其特征在于，冻存液的配制方法是：在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和黄芪提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为5～10％，右旋糖苷的浓度为1～5％，香菇多糖的浓度为2～10％，羟乙基淀粉的浓度为3～5％，黄芪提取物FQR-8的浓度为1～3％。

3.权利要求1所述的保存方法，其特征在于，在液氮中保存的时间是180天。

4.权利要求2所述的保存方法，其特征在于，淋巴细胞无血清培养基的名称为AIM-Medium CTSTM#087-0112DK，购置于美国Gibco公司。

5.权利要求1所述的保存方法，应用于DC-CIK细胞的保存。

6.权利要求1所述的保存方法，其特征在于，

冻存液的配制：

在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和人参提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％，右旋糖苷的浓度为5％，香菇多糖的浓度为5％，羟乙基淀粉的浓度为5％，黄芪提取物FQR-8的浓度为1％；

或者，

在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和人参提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％，右旋糖苷的浓度为3％，香菇多糖的浓度为3％，羟乙基淀粉的浓度为3％，黄芪提取物FQR-8的浓度为1％；

或者，

在淋巴细胞无血清培养基中加入自体血浆、二甲基亚砜、右旋糖苷、香菇多糖、羟乙基淀粉和人参提取物FQR-8，使得自体血浆的浓度为1％，二甲基亚砜的浓度为10％，右旋糖苷的浓度为5％，香菇多糖的浓度为5％，羟乙基淀粉的浓度为5％，黄芪提取物FQR-8的浓度为2％；

黄芪提取物FQR-8的制备：

利用颗粒粉碎机将黄芪生药粉碎，经过炒制为熟黄芪，加入适量的去离子水后打成浆液，加入纤维素酶30min后灭活、高速离心、取上清液，上清液经过浓缩后制成浓缩液，再次离心，上清液加入乙醇，4℃过夜沉淀后离心得到沉淀物，沉淀物用去离子水溶解后，以一定的流速加到预处理的大孔吸附树脂XAD-16柱的上端进行吸附，先用去离子水缓慢清洗，以除去树脂表面或内部残留的多糖或无机盐等非极性或水溶性较大的强极性杂质，然后依次用20％甲醇、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇、100％甲醇4℃下以，流速0.18～0.20cm/min进行洗脱，分别收集洗液，利用紫外分光光度计检测洗脱液在420nm下的OD值，将有最大吸收的组分用旋转蒸发仪适当蒸去甲醇和部分水分，冷冻后，真空冷冻干燥，获得白色粉末即为FQR-8，

FQR-8诱导的DC-CIK细胞的培养：

细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加到淋巴细胞分离液表面，2500rpm离心20min；用一次性塑料巴氏小心收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml一次性离心管中，加入生理盐水至50ml，混匀，室温1500rpm离心沉淀10min，弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温1300rpm离心7min，弃上清；细胞沉淀物用RPMI1640培养液调整细胞密度为(4～6)×10⁶个/ml，置于37℃、5％CO₂，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养2小时；收集非贴壁细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为(1～2)×10⁶个/ml，进行体外诱导，在含浓度为10ug/ml的人参提取物FQR-8、1000U/ml rhIFN-γ的完全培养基中悬浮培养24小时后，加入rhIL-1α100U/ml、鼠抗人CD3McAb 50ng/ml、rhIL-2 1000U/ml，继续培养，以后隔天更换新鲜培养液一次，补充rhIL-2，细胞密度维持在(1～2)×10⁶个/ml；将贴壁细胞接种于6孔培养板，加入含rhIL-4 500U/ml、rhGM-CSF 100ng/ml、FQR-8 10ug/ml的RPMI1640培养液，置于37℃、5％CO₂，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，隔日半量换液，适时补充培养基及细胞因子；在培养第6天，加入终浓度为100ng/ml的rhTNF-α；分别收获CIK、CD细胞，计数后1:5的比例混合后，体外培养5天，获得DC-CIK细胞，

DC-CIK细胞的冻存

用细胞冻存液悬浮DC-CIK细胞，得到10⁷个细胞/ml的细胞悬液，分装入冻存管中，每个冻存管中吸入1ml的细胞悬液；

将上述步骤中的冻存管，放入程控降温仪的冻存盒中进行冻存，随后取出冻存管迅速放置于液氮中，程控降温仪的设定参数是：4℃～-20℃，1℃/每分钟；-20℃等待20min；-20℃～-40℃，4℃/每分钟；-40℃等待30min；-40℃～-80℃，8℃/每分钟；-80℃等待2h。