[发明专利]一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及免疫吸附剂及其制备方法，还涉及一种制备该免疫吸附剂的免疫亲和柱的制备方法，属于食品科学技术领域。

背景技术

黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1,AFM1）主要存在于乳中，因此最初被称为“牛奶毒素”，由de Iongh等发现后发表在1964年的Nature杂志上。随着研究的深入发现，AFM1是黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是在体内经细胞色素P450系列酶的作用下经羟基化所形成的，一般认为AFB1的羟基代谢物是毒素的解毒形式。然而AFM1不能被看作是AFB1的解毒产物，有许多实验研究表明AFM1都具有细胞毒性和致癌性，是目前影响乳制品安全性的重要有害物之一。

由于黄曲霉毒素M1（简称AFM1）耐高温而且稳定性强，在乳制品的加工过程中通常无法通过高温杀菌工艺直接去除，因此，目前还没有通过直接技术手段去除乳中AFM1的污染的方法，控制乳中AFM1的措施只有采用严格的法定残留限量标准和精密检测技术来进行，一旦超标就需要将污染AFM1的乳液进行销毁，常造成巨大的经济损失。典型案例就是2011年国家质检总局公布了蒙牛乳业（眉山）有限公司和福建长富乳品有限公司生产的液体奶中含超标AFM1后引起了社会极大的恐慌，同时也对乳业公司造成了巨大的经济损失。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，该抗体具有很高的分泌特异性和亲和力，能够特异性结合乳中AFM1。本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种由上述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体制备的免疫吸附剂及其制备方法。本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种由上述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体制备的免疫亲和柱及其制备方法。

本发明要解决的技术问题是由如下方案实现的：

1、一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的重链为IgG2b型，轻链为λ型，所述轻链氨基端前15个氨基酸序列为GVTQESALTTSPGGT，所述重链氨基端前15个氨基酸序列为EVILVESGGGLVKPG，分子量为150KD；所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体与黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和BSA的交叉反应率分别为100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%，亲和常数为5.5×10-10mol/L。

所述黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株系的获得

该杂交瘤细胞株系是用完全抗原AFM1-BSA免疫小鼠后所得的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合得到，传代30代分泌抗体活性无差别，杂交瘤细胞在无血清培养基中能稳定分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，在CO2培养箱中培养至细胞全部死亡后培养基中抗AFM1的抗体浓度可达0.15mg/mL；

（2）抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株系的筛选

所述抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选采用高通量对比ELISA方法，筛选过程包括以下步骤：

选择免疫效价超过10^-5以上的小鼠脾脏细胞进行追加免疫，3天后取脾细胞与SP2/0细胞按1：1的比例在分子量为1450的50%PEG作用下进行细胞融合，融合细胞利用HAT培养基调整细胞密度后均匀分配到45块96孔板中，在5%的CO₂和37℃的培养箱培养10天；10天后在吸取上清液进行阳性孔的筛选，筛选采用在预先准备好的BSA和AFM1-BSA包被板各45块96孔板利用全自动加样器、Transtar-96等设备移液、洗板、加2抗、加显色液、加终止液后用酶标仪测定OD值，依据拖孔数和在AFM1-BSA包被板中的显阳性而在BSA包被板中显隐性的细胞孔为第一次筛选对象，利用显微操作技术分别吸取阳性孔的各个融合细胞集落转入新的96孔培养板中培养，培养基变色后进行亚克隆，获得稳定分泌抗AFM1单克隆抗体的细胞株系；

（3）抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备

采用蛋白A/G纯化，包括以下具体步骤：