[发明专利]一种腈水解酶重组表达菌株的构建及其高密度发酵方法

权利要求书

1.一种表达组成型重组腈水解酶、能转化3-氰基吡啶合成烟酸的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)NIT-1，现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路一号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.14254，保藏日期2017年6月19日。

2.一种权利要求1所述的大肠埃希氏菌NIT-1的高密度发酵方法，其特征在于，将大肠埃希氏菌NIT-1斜面菌种进行活化，以2～5％的接种量转接至新鲜的种子培养基中，在30～40℃条件下培养8～16h；按照5～20％接种量转接至发酵罐中，利用pH电极和溶氧电极实时监测发酵液的pH和溶氧值，通过调节转速和通气量，使溶氧维持在10～20％；在分批发酵阶段，流加25％氨水(V/V)使发酵液pH不低于6.8，分批发酵阶段葡萄糖消耗完后进入补料阶段，采用pH-stat补料策略进行发酵，在补料前期，通过流加氨水的调控方式设置pH稳定在6.8，每升高0.01即开始流加补料培养基；补料中期，设置pH每升高0.03即开始流加补料培养基；补料后期设置每升高0.05开始补料；发酵转速维持在600rpm以内；所述发酵罐发酵培养基组分为：胰蛋白胨10～20g/L，酵母粉5～15g/L，NaCl 0.1～1g/L，KCl 0.1～0.5g/L，MgCl₂ 0.5～1g/L，葡萄糖5～20g/L，微量元素1～5mL/L；所述补料培养基组分为：葡萄糖500～1000g/L，MgSO₄ 10～20g/L，微量元素10～20mL/L；所述发酵罐内添加终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素；所述的微量元素的组分为：FeCl₃·6H₂O 6g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.58g/L，CaCl₂ 0.2g/L，CuCl₂·2H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.3g/L，EDTA 0.5g/L，pH 6.0～7.0。

3.一种权利要求1所述的大肠埃希氏菌NIT-1转化合成烟酸的方法，其特征在于：以大肠埃希氏菌NIT-1游离细胞为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，在pH 7.2的磷酸盐缓冲液中构成转化反应体系，在30℃条件下进行转化反应，采用HPLC检测转化液中底物残留情况，采用批次底物投料的模式进行生物转化反应，所述体系中底物投料浓度为100～300mM，最终烟酸累积浓度可达300～600g/L。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于大肠埃希氏菌NIT-1在生物转化过程中所采用的浓度，以菌体干重计为1.5～5.0g/L。