[发明专利]一株分泌抗丁香酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株CS12及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株分泌抗丁香酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株CS12及其应用，可用于鱼肉中丁香酚残留的检测，属于食品安全免疫检测技术领域。

背景技术

丁香酚类化合物，主要包括丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚、甲基异丁香酚、乙酰基异丁香酚等，其主要官能团为与苯环相连的酚羟基、烯丙基以及一个甲氧基及其衍生物，具有麻醉、抑菌、抗氧化等多种药理作用。然而其在渔用麻醉运输方面较其他的麻醉剂具有成本低、效果好以及残留期短的特点，近几年各国都有将其应用于渔业生产与活鲜水产品流通运输领域的报道。而美国国家毒理学计划（NTP）发布的毒理学数据显示，丁香酚类化合物（包括丁香油、丁香酚、甲基丁香酚、异丁香酚）对啮齿动物是致癌物或潜在的致癌物。

因此，其安全性值得怀疑。虽然有些国家如澳大利亚、新西兰、智利等将丁香酚类化合物列为没有残留期的合法水产麻醉剂应用于亲鱼采卵、活鱼运输以及手术过程的麻醉，但都严格规定了其休药期和残留量。而我国，至今并没有相关部门正式审批丁香酚类渔用麻醉剂应用于水产品中的规定。因此，急需建立水产品中丁香酚类化合物的快速检测方法。

目前，国内外报道的丁香酚化合物检测主要是通过高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱串联质谱、TLC 法和毛细管电泳法等。但这些方法的样品前处理过程复杂，实验周期长，不适合大量样本的快速检测。酶联免疫分析方法（ELISA）是一种半定量的、简单、灵敏、快捷和高通量的检测方法，对于食品中药物残留的检测有重要意义。但目前没有抗丁香酚单克隆抗体制备的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株分泌抗丁香酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株CS12及其应用，由该细胞株制备的抗体对丁香酚具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立ELISA方法。

本发明内容包括两个方面，单克隆抗体的制备和其应用。抗丁香酚单克隆抗体是通过小鼠免疫丁香酚免疫原获得。免疫原和包被原都是由丁香酚的结构类似物阿魏酸通过活泼酯法合成。筛选血清阳性高抑制好的小鼠取脾脏，将脾细胞与Sp2/0瘤细胞融合。融合后用间接ELISA方法检测细胞上清，筛选对阳性高且对丁香酚抑制好的细胞进行亚克隆，进行三次亚克隆，获得纯的细胞株。将细胞株注射进打过石蜡油的小鼠的腹腔制备腹水，获得的腹水用辛酸-硫酸铵方法进行纯化。测定单克隆抗体对丁香酚的半数抑制浓度(IC₅₀)，以及对其结构类似物的IC₅₀，计算交叉反应率。将丁香酚药物添加入鱼肉中，进行样本添加回收实验，计算回收率。

本发明的技术方案：一株分泌抗丁香酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株CS12，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13085，保藏日期为2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。

抗丁香酚单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.13085的杂交瘤细胞株CS12分泌产生。

所述抗丁香酚单克隆抗体的应用，用于鱼肉中丁香酚残留的检测。

本发明的有益效果：本发明采用间接竞争ELISA测定细胞株CS12分泌的单克隆抗体，对丁香酚的IC₅₀为1.28 μg/mL。对鱼肉中丁香酚的回收率范围为96.8%～115.6%。为鱼肉中丁香酚残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株分泌抗丁香酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株CS12，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13085，保藏日期2016年10月31日，分类命名为单克隆细胞株。

附图说明

图1 CS12分泌的单克隆抗体对丁香酚的标准抑制曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1 免疫原和包被原合成