[发明专利]一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法

权利要求书

1.一种定量测定尿液中甘胆酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合、孵育，得到检测样；

其中，甘胆酸示踪物具有式(Ⅰ)所示结构：

甘胆酸多克隆抗体是由甘胆酸与牛血清蛋白偶联所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；

b)对所述检测样进行荧光偏振光检测，获得偏振光强度；

c)根据所述偏振光强度与预定的甘胆酸标准曲线，得到尿液待测样中甘胆酸的浓度。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，甘胆酸示踪物工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸示踪物稀释到一定稀释度的稀释液；

所述甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度为1∶16000；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液为以硼酸盐缓冲液为稀释剂，将甘胆酸多克隆抗体稀释到一定稀释度的稀释液；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度为1∶1000。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤c)中，预设的甘胆酸标准曲线通过以下方式获得：

用PBS缓冲液将甘胆酸配制成系列浓度的甘胆酸标准液；

对所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的系列总混合液进行荧光偏振光检测，获得系列总混合液的系列偏振光强度mP；

对PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液经混合孵育所得的总空白液进行荧光偏振光检测，获得总空白液的偏振光强度mP₀；

根据mP/mP₀的比值和相应的甘胆酸标准液的浓度，获得甘胆酸标准曲线。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述甘胆酸示踪物工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液中，硼酸盐缓冲液的浓度为1～8mmol/L，PH值为7.0～8.5。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L，PH值为7.4。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，尿液待测样、甘胆酸示踪物工作溶液和甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。

7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述系列浓度的甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，甘胆酸标准液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10；

PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液混合孵育时，PBS缓冲液、甘胆酸示踪物工作溶液与甘胆酸多克隆抗体工作溶液的体积比为1：10：10。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甘胆酸示踪物通过以下方式获得：

将甘胆酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基二亚胺溶于二甲基甲酰胺中，形成混合液；

将所述混合液与4-胺甲基荧光素混合反应，得到反应液；

以体积比为4∶1的氯仿与甲醇的混合物为层析液，采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯，得到甘胆酸示踪物。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，在采用TLC薄层色谱纯化方法对所得反应液进行薄层层析和分离提纯后，用甲醇萃取，得到具有不同Rf值的分离物，选择Rf值为0.94的分离物为甘胆酸示踪物。

10.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤a)中，甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度通过以下方式获得：

用硼酸盐缓冲液将所述甘胆酸示踪物稀释成系列稀释度的示踪物供试液并进行荧光偏振光检测，获得系列稀释度的示踪物供试液的偏振光强度；

以硼酸盐缓冲液为空白溶液并进行荧光偏振光检测，获得空白溶液的偏振光强度；

选择偏振光强度为空白溶液偏振光强度10～15倍的示踪物供试液的稀释度为甘胆酸示踪物工作溶液的稀释度；

所述甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度通过以下方式获得：

用硼酸盐缓冲液将甘胆酸多克隆抗体稀释成系列稀释度的抗体供试液，分别与所述甘胆酸示踪物工作溶液混合、孵育，得到系列抗体-标记物混合液；

分别对所述系列抗体-标记物混合液进行荧光偏振光检测，获得系列抗体-标记物混合液的偏振光强度；

根据系列抗体-标记物混合液的偏振光强度和相应的抗体供试液的稀释度，获得抗体供试液曲线；

选择抗体供试液曲线中最大偏振光强度的70％为标准偏振值，以所述标准偏振值所对应的稀释度为甘胆酸多克隆抗体工作溶液的稀释度。