[发明专利]一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及传感平台检测领域，更具体的说是依赖锌离子连接作为扩增生物催化剂的脱氧核酶为分析microRNA (miRNA)荧光提出一个传感平台，利用这个平台为检测miRNA 构建一个通用的路径。

背景技术

癌症是目前全球都在攻克的难题，是一个造成死亡的主要原因，每年死于癌症的患者很多，所以癌症的早期诊断变得尤为重要，miRNA作为基因表达的重要调节器，肿瘤发生时，miRNA调节致癌与肿瘤抑制途径。在某些肿瘤中单个miRNA常发生复发性遗传和表观遗传的改变，相关研究也进一步阐明了公认的致癌和抑癌基因的作用机制。MiRNA不仅和癌症的发生有关，而且能够为癌症的相关治疗提供新的工具和希望。let-7在人类胚胎发育时期很难被检测到，但在成年时期变的相当丰富，在人类胚胎细胞分化过程中表达明显增加。let-7在肺癌组织中表达降低，恢复其正常表达有明显的肿官抑制作用。因此，我们现在需要发展更简单、准确、快捷、灵敏度高、选择性好的检测方法，用于癌症早期的检测判断。

miRNA表达的专一信号已经在临床组织样本中被发现，而且miRNA比mRNA更稳定，故可以将miRNA作为诊断中新型的生物标记物。同时研究表明miRNA能存在于极端的环境中，如酶促降解、冷冻、熔化、强酸强碱环境中。另外，miRNA在所有的体液和分泌物中也能被检测出来，包括尿液、排泄物、唾液、眼泪和羊水等。miRNA的检测分析技术对推进miRNA生物功能的进一步研究至关重要，并将形成以miRNA为疾病标志物的新诊断技术。但是绝大部分miRNA分子在细胞内的表达程度比较低，同源miRNA之间相似程度又高，所以发展简单、快速、准确、高灵敏度、高选择性的miRNA的检测方法对于miRNA生物功能的研究及以miRNA为生物标志物的疾病诊断都有重要意义。

检测miRNA的传统方法有Northern印迹法，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和微阵列法。然而，这些方法都有一些缺点。例如，Northern印迹是长而复杂的程序，需要放射性标记并且检测限通常低，而RT-PCR和微阵列具有良好的灵敏度，但需要昂贵的仪器。因此，我们需要发展灵敏度高、成本低的检测方法，现在出现了许多新的检测方法，如环诱导等温扩增技术、滚环扩增技术、分子信标等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是依赖锌离子连接作为扩增生物催化剂的脱氧核酶为分析microRNA (miRNA)荧光提出一个传感平台，利用这个平台为检测miRNA 构建一个通用的路径。

一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法，其特征是包括以下步骤：

1.1测定荧光光谱溶液的制备

所有的检测都在包含100 nM 氯化钠10 nM的氯化镁的10 nM 4-(2-乙基)N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸钠盐缓冲剂(pH=7.0)中进行；工作溶液包括0.5 μM的脱氧核酶亚基(4)和(5)，1 μM 底物亚基(2)和(3)，发夹探针的0.5 μM (8)，1 mM 锌离子，再加入不同浓度的目标miRNA，混合溶液继续培育扩增1.5小时在25 °C的环境下，各样品的体积均为20 μL，连接后，样品被稀释到50 μL；其中底物(2)需要用咪唑(pH=6.0，用HCl调节)、EDC·HCl修饰；方法：40 μL 10 μM的底物(2)与5 μL 0.1 μM咪唑和5 μL 0.1 μM EDC·HCl，25 °C培养2小时，再利用色谱分析柱(G-25)纯化底物；

1.2形成再生脱氧核酶

脱氧核酶序列(4)与改良咪唑底物亚基(2)和羟基化的亚基(3)结合，在锌离子的存在下连接到3′和5′各自底物亚基的末端；通过发夹域连接脱氧核酶是稳定的，包括亚基(4)与底物亚基(2)脱氧核酶序列的一部分结合； 脱氧核酶(5)脱氧核酶的第二段序列，结构域(I)的一个扩展的发夹结构域(II)；得到结合第二个底物亚基(3)的核酸(5)；在分析物(1)的存在下，发夹结构域(II)打开，使2个脱氧核酶和底物亚基(4)/(2)和(5)/(3)自组装在一起；在锌离子的存在下，脱氧核酶是有活性的，导致连接亚基(2)和(3)形成连接产品(7)；

1.3第一扩增步骤