[发明专利]一种检测4种致病菌的四重实时荧光PCR方法

权利要求书

1.一种检测4种致病菌的四重荧光PCR方法，具有四重荧光PCR技术的4个要素，即：样品DNA、一对通用引物和四条探针、荧光PCR预混液、阳性对照；其特征在于：根据4种致病菌的16S rRNA基因设计引物和探针，对目标序列进行扩增并激发相应的荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号；将待测样品DNA进行荧光PCR扩增的试剂配方和扩增条件制成试剂盒；所述4种致病菌是：金黄色葡萄球菌，学名Staphylococcus aureus，简称St.aureus；肠道沙门氏菌，学名Salmonella enterica，简称Sa.enterica；单核细胞增生李斯特菌，学名Listeria monocytogenes，简称L.monocytogenes；副溶血性弧菌，学名Vibrioparahemolyticus，简称V.parahemolyticus；所述样品为食品样品；

具体的做法包括：

第一步，建立检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR引物体系；

第二步，建立检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR试剂盒；

第三步，确定检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR鉴定方法，即以待测样品总DNA为模板，利用所述的四重荧光PCR引物体系，在可同时检测FAM、VIC、TARMA、Cy5激发荧光基团和MGB淬灭荧光基团的四通道及以上的荧光PCR仪上进行扩增和检测；

所述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR引物体系：序列1为St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的通用上游引物，序列2为St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的通用下游引物，序列3为St.aureus特异性探针，序列4为Sa.enterica特异性探针，序列5为L.monocytogenes特异性探针，序列6为V.parahemolyticus特异性探针；序列3、4、5、6在5’端分别用FAM、VIC、TARMA、Cy5荧光激发基团修饰，3’端均为MGB荧光淬灭基团修饰。

2.按照权利要求1所述的四重荧光PCR方法，其特征在于所述检测St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus的四重荧光PCR试剂盒成分如下所示：

①引物：包括序列1、2所示引物，浓度均为20μmol/L，使用1.5mL无色透明离心管封装；

②探针：包括序列3、4、5、6所示探针，浓度均为10μmol/L，使用1.5mL棕色不透明离心管封装；

③荧光PCR试剂：经验证可适用于所述的四重荧光PCR引物体系的外购的试剂套装，包括荧光PCR预混液、ROX染料、三蒸水；

④阳性对照：包括含有序列1和序列2所示引物扩增目的片段的St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus源性DNA，浓度均为10⁵拷贝/μL，使用1.5mL无色透明离心管封装；

⑤阴性对照：阴性对照为非St.aureus、Sa.enterica、L.monocytogenes、V.parahemolyticus源性DNA或三蒸水；

⑥空白对照：为三蒸水。