[发明专利]一种脐血Treg细胞的体外扩增方法

权利要求书

1.一种脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述提取方法包括以下步骤；

S1：从脐血中分离单个核细胞；

S2：采用培养基将单个核细胞的细胞密度调整至0.1×10⁶/ml～10×10⁶/ml，然后将该密度的单个核细胞接种至培养瓶，添加灭活血浆；

第一天：向培养瓶中加入拟雌内酯、TGF-β、CD3/CD28单克隆抗体和IL-2；

S3：第四天：补加培养基，并添加灭活血浆、拟雌内酯、TGF-β、CD3/CD28单克隆抗体和IL-2并使其终浓度与步骤S2中各种成分的终浓度一致；

S4：第六天：补加培养基，并添加灭活血浆、拟雌内酯、TGF-β、CD3/CD28单克隆抗体和IL-2并使其终浓度均保持不变；

S5：第九天：补加培养基，并添加灭活血浆、拟雌内酯、TGF-β、CD3/CD28单克隆抗体和IL-2并使其终浓度均保持不变；

S6：第十二天：收集细胞，其细胞扩增倍数达250倍，细胞纯度大于80％。

2.根据权利要求1所述的脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤S1中，分离单个核细胞的方法为：取脐血，并在600～900g/min离心10～20min，收集上层血浆，将血浆置于50～60℃灭活20～40min，2500rpm/min离心后备用；然后加入等体积PBS稀释剩余的血细胞，用常规密度梯度离心的方法分离脐血。

3.根据权利要求1所述的脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤S2中，采用培养基将单个核细胞的细胞密度调整至1×10⁶/ml，然后进行接种，接种后添加灭活血浆至该灭活血浆终浓度为3～7％。

4.根据权利要求3所述的脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述灭活血浆添加至其终浓度为5％为止。

5.根据权利要求1所述的脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤S2中，所述拟雌内酯、TGF-β、CD3/CD28单克隆抗体和IL-2的加入量为：加入至其终浓度分别为拟雌内酯1～500ng/ml、TGF-β1～10ng/ml、CD3/CD28单克隆抗体0.5～4μg/ml和IL-21000～3000U/ml为止。

6.根据权利要求5所述的脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤S2中，所述拟雌内酯、TGF-β、CD3/CD28单克隆抗体和IL-2的加入量为：加入至其终浓度分别为拟雌内酯100ng/ml、TGF-β5ng/ml、CD3/CD28单克隆抗体2μg/ml和IL-2 2000U/ml为止。

7.根据权利要求6所述的脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤S3中，培养基的补加量为步骤S2中接种至培养瓶中体积量的0.5～0.7倍；

步骤S4中，培养基的补加量为步骤S2中接种至培养瓶中体积量的1.3～2.0倍；

步骤S5中，培养基的补加量为步骤S2中接种至培养瓶中体积量的3～5倍。

8.根据权利要求7所述的脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤S3中，培养基的补加量为步骤S2中接种至培养瓶中体积量的0.6倍；

步骤S4中，培养基的补加量为步骤S2中接种至培养瓶中体积量的1.6倍；

步骤S5中，培养基的补加量为步骤S2中接种至培养瓶中体积量的4倍。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤S2～S6的细胞培养中，所述的培养基为RPMI1640培养基。

10.根据权利要求9所述的脐血Treg细胞的体外扩增方法，其特征在于：步骤S2～S6中，细胞培养均在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。