[发明专利]一种适用于鱼类血细胞快速分类计数的方法及应用

说明书

本发明公开了一种适用于鲫鱼、鲤鱼等常见鱼类的血细胞高通量快速分类分析方法。针对无法去除的有核红细胞在数量和形态两方面干扰白细胞分类计数的问题，利用荧光染料与多通道图像相结合的自动化测量和分析策略，依据细胞内颗粒、细胞核形态及位置等差异，将干扰的红细胞样点与白细胞分开，并划分出淋巴细胞、单核细胞和颗粒细胞等承担重要免疫功能的不同白细胞类群范围，完成自动分析。无法有效去除有核红细胞的难点长期困扰很多种类动物的血象自动化分析，本发明把荧光染料与图像分析相结合，利用多维全景分析仪高通量，高灵敏的测量模块，准确识别出红细胞类群，排除其干扰，为聚焦分析白细胞类群提供了重要的技术支持，有广阔应用前景。

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及利用荧光染料与多通道图像相结合的新型自动化细胞检测技术，分析鲫鱼全血中各类血细胞种类和数量和比例的方法。本方法能简便、快速、准确、高通量检测鲫鱼血细胞种类和数量比例，可对尚无有效裂红试剂的鲫鱼血细胞进行更为精准的高效的自动化分析，避免了繁重的人工分类计数，以及人工辨识差异导致“因人而异的”结果偏差，解决了由无法去除的数量百倍于白细胞的大量红细胞对白细胞分类计数干扰的主要问题，实现了给鱼快速“验血”。

背景技术

血象是指血液一般检验结果的总称。例如，医学血常规检查就是一种血象分析，包括对血液细胞数量和质量的化验检查等，白细胞数目增高，常见于细菌感染、应激等；白细胞减低则多见于病毒感染、自身免疫性疾病等；嗜酸细胞比例上调，往往提示寄生虫感染、过敏等。血细胞是生物体免疫系统的重要组成部分，任培丽等（2008）发现鱼类外周血细胞数量及比例可以反映宿主健康状况。当鱼类处于某些非健康状况时，其外周血中红细胞数目会显著减少，白细胞数量则显著增加。Claver等（2009）提出鱼等非哺乳类脊椎动物的不同的类型的血细胞中的各个类群的白细胞细胞直接参与了众多免疫应答及相关的过程，对自身生理状态变化和外界环境因子的刺激十分敏感。生理及病理状态往往都能在血细胞的组成和丰度等方面有明确的反应，可以据此了解鱼类的健康状况。

多维全景检测仪是一种新型的图像辅助分析设备，它可以借助类似流式的上样模块，将待分析颗粒均匀分配于流动液滴中，再通过多维全景检测器采集相关数据，可对包括细胞在内的多种样品进行大小、颗粒度、长宽比，散射等几十种特征的分析；更为重要的是，该仪器能够对每个样点进行各个检测通道的图像采集，实现多维而且全景的分析。相较于常规流式细胞仪需要分选模块来收集待测细胞进行后续的繁琐的鉴定的分析不同，多维全景可以实时呈现并记录结果，便于随时调用分析，类似于传照相与数码照相的差别。Samsel等（2015）提出在医学领域可以利用该类图像辅助的仪器根据细胞数量及形态测量的偏移和变化诊断相关疾病，有很好的应用前景。图像辅助不但极大的节约时间和成本，而且对于没有特定筛选抗体的低等动物而言，这种实时、实景的分析能力是之前各项技术都无法比拟的。边界细胞以及低丰度类群细胞的分类关乎鉴定结果的准确性，但常规流式检测方法需要先回收再鉴定，而低丰度以及边界类群的少量细胞难以逐一回收鉴定，因此在水生动物血细胞分类方面尚未有成熟的高通量、自动化的方法。多维全景检测仪具有多通道同步采集图像的功能，实现一劳永逸的数据测量和保存，仅需一次上样即可，随时选择任何位置的任何一群甚至一个细胞进行精确比较，确保分群和统计结果的准确性；另一方面，多维全景分析仪的上样模块可以提供理想的检测速度，每分钟数万样本的通量是检测结果可靠性和重现性的重要保证。由此可见，常规流式不能采集样品图像，而一旦把细胞收集后就不能再放回原样品进行调整分群处理；而本发明使用多维全景分析仪，其采集的图像可以随时调用、匹配，根据图像特征精准调整分群，实现各类细胞的准确区分和分析。