[发明专利]基于TaqMan‑MGB探针检测人非结合分枝杆菌和结合分枝杆菌的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地说，涉及一种基于TaqMan-MGB探针检测人非结合分枝杆菌和结合分枝杆菌的试剂盒及方法。

背景技术

分枝杆菌属(Mycobacterium)隶属于细菌域，放线菌门，放线菌纲，放线菌目，棒杆菌亚目，分枝杆菌科。分枝杆菌种类可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis),是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)在流行上相互促进。流行病学研究显示，HIV是促进结核病流行的动力因子，结核病是AIDS患者最常见的机会性感染。2014年的HIV致死人数估计为120万人，其中包括HIV阳性患者中的40万结核病死亡病例。2014年全年960万结核病新病例中有12％为HIV阳性患者。在这960万结核病新病例中，58％发生在东南亚和西太平洋区域，非洲区域占有2014年全世界病例的28％，每10万人有281起病例，比全球133的平均值多一倍以上。印度、印度尼西亚和中国的病例数最多：分别占全球总数的23％、10％和10％。

近年来，艾滋病在全球流行后，非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)感染的发病率迅速上升。AIDS合并肺部NTM感染主要由鸟分枝杆菌复合物(Mycobacterium avium complex,MAC)所致，鸟分枝杆菌复合物主要包括鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)和胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)，属于Ⅲ型不产色的慢速生长的非结核分枝杆菌，主要侵犯肺部。不仅能引起AIDS患者肺部感染，还能导致AIDS患者全身播散感染、淋巴结炎及皮肤感染。MAC全身播散感染常伴贫血、发热、盗汗和腹泻等症状。有文献报道NTM肺病具有与肺结核临床表现相似的全身中毒症状和局部损害表现，在无菌种鉴定结果的情况下，可被误诊为肺结核病。涂片并不能区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，只能依靠菌种培养鉴定，然而培养周期长，一般长达几周，这给结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的鉴别带来了阻碍。分子生物学鉴定方法有PCR-限制性片段长度多态性分析(RFLP)和DNA分子杂交，但只能鉴定部分分枝杆菌，重复性差。

TaqMan-MGB探针法荧光定量PCR是利用Taq酶的5’外切酶活性，依据目的基因设计合成能与之特异性杂交的探针，探针的5’端标记荧光基团，3’端标记猝灭基团，Taq酶可用外切酶活性，将荧光基团从探针上切割下来，从而发出荧光，可根据PCR体系中的荧光强度计算初始DNA模板的数量。而MGB是加在3’端的小沟结合物，可稳定探针与模板的杂交，提高探针Tm值。TaqMan-MGB荧光定量PCR技术在临床病人病原菌检测方面已经起着不可或缺的作用，与传统的方法相比，TaqMan-MGB荧光定量PCR技术检测速度快、特异性强、污染小，并逐渐应用于多种病原菌的检测中。

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明提供一种高度特异性、高敏感性、稳定性好的TaqMan实时荧光定量PCR检测人非结合分枝杆菌和结合分枝杆菌的试剂盒及方法。

本发明为了实现以上目的，选取分枝杆菌的16S rRNA的基因(结核分枝杆菌基因序列GenBank号为CP016972.1，鸟分枝杆菌基因序列GenBank号为X52918.1，胞内分枝杆菌基因序列GenBank号为NR_042165.1)为目标序列。通过比对结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌基因序列，选择在相同区域设计一对通用引物，分别扩增出137bp，135bp，135bp的片段。在这片段中同时还具有特异性差异序列，在这部分区域进行探针设计，设计三条特异性鉴定分枝杆菌的探针，利用TaqMan探针荧光定量PCR技术建立检测该菌的实时荧光定量PCR方法。

本发明提供用于检测人非结合分枝杆菌和结合分枝杆菌的TaqMan实时荧光定量PCR引物和三条探针，

所述引物包括：

上游引物All-F:5’-GATGCCTGGGAAACTGGGTCTAATA-3’(SEQ NO:1)

下游引物All-R:5’-CCCGTCGTCGCCTTGGTAGGC-3’(SEQ NO:2)