[发明专利]拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂、试剂盒、应用及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学检测领域，尤其涉及一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂、试剂盒、应用及检测方法。

背景技术

我国宁夏枸杞已大量生产并进行出口贸易，但枸杞病虫害发生严重，主要病虫害一年发生多代，虫类同期、虫态生活史重叠现象极为普遍，防治难度大，其中虫害有38种，病害有5种，早在2002年宁夏就已在全国率先开展“无公害枸杞行动计划”，选用高效低毒低残留农药，如拟除虫菊酯类农药、新开发的杂环类农药(吡虫啉)、生物源农药(苦参碱)等用于枸杞虫害防治。并对氰戊菊酯、氯氰菊酯及溴氰菊酯等具有间苯氧基苯甲酸(PBA)结构的菊酯类农药进行研究。

目前国内外采用的农药残留检测方法主要有色谱法、波谱法和仪器分析法(如GC、HPLC、GC/MS、LC/MS、GC/MS+MS、LC/MS+MS)。以上方法虽检测准确，但成本高，耗时长，需要具备一定技术水平的专业人员才能进行操作，只适合在实验室进行，限制了该方法在大规模的农药残留监测和现场实时检测中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂、试剂盒、应用及检测方法，主要目的是解决使用不方便、成本高及检测慢的问题。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂，所述检测试剂包括拟除虫菊酯的单克隆抗体。

作为优选，所述拟除虫菊酯残留为枸杞中拟除虫菊酯类农药残留。

作为优选，所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

用碳二亚胺法将间苯氧基苯甲酸和牛血清蛋白偶联合成免疫抗原；

用羰基二咪唑法将间苯氧基苯甲酸和鸡卵清蛋白偶联合成检测抗原；

用所述免疫抗原免疫小鼠，将其脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞；

用ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞；

用有限稀释法对所述杂交瘤细胞进行克隆并分离阳性杂交瘤细胞株，获得稳定分泌抗拟除虫菊酯的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

采用腹水诱导法，将含有所述杂交瘤细胞株的培养液注入小鼠腹腔产生腹水，所述腹水含有所述拟除虫菊酯的单克隆抗体。

另一方面，本发明实施例提供了一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂盒，包括：

96孔酶标板；

检测抗原PBA-OVA；

拟除虫菊酯单克隆抗体；

HRP标记的羊抗鼠酶标二抗；

间苯氧基苯甲酸标准品溶液；

碳酸盐缓冲液，0.1M，pH＝9.6；

洗涤液PBST，0.01M，pH＝7.4

底物TMB显色液，0.15mg/ml；

反应终止液，2mol/L H₂SO₄。

又一方面，本发明实施例提供了上述检测试剂在制备拟除虫菊酯残留的ELISA检测试剂盒中的应用。

再一方面，本发明实施例提供了一种拟除虫菊酯残留的ELISA检测方法，所述方法包括以下步骤：

用碳酸盐缓冲液将检测抗原稀释至1μg/ml，加入96孔酶标板，每孔加入100μL，4℃包被过夜；

向每孔中加入250μL洗涤缓冲液洗涤3-5次，弃洗涤液，拍干；

向96孔酶标板中加入枸杞样本50μl，拟除虫菊酯单克隆抗体50μl，加入空白对照，25℃反应30min；

向每孔中加入洗涤液洗涤3-5次，弃洗涤液，拍干；

向96孔酶标板每孔中加入用封闭液稀释1000倍的，HRP标记的羊抗鼠酶标二抗，每孔100μL，25℃避光反应30min；

向每孔中加入洗涤液并洗涤3-5次，弃洗涤液，拍干；

向96孔酶标板中加入酶底物TMB显色剂，每孔加入100μL，室温避光反应15min；

向96孔酶标板中加入终止液，每孔100μL，终止反应，用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度OD值；

结果判断：用磷酸盐缓冲液将间苯氧基苯甲酸标准品分别稀释成浓度为0，125，250，500,1000及2000ppb的五个不同浓度后检测OD值；