[发明专利]一种检测黄瓜花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测黄瓜花叶病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员，在世界范围内均有分布。其寄主范围广泛，可侵染52科174属的775种植物。自然侵染寄主有黄瓜、烟草、心叶烟、菜豆、苋色藜、昆诺藜和豇豆等，可通过种子、鳞茎、块茎及苗木等无性繁殖材料实现远距离传播。但是，从百合植株上获得的CMV株系均不能通过汁液摩擦接种侵染昆诺藜、苋色藜、普通烟、心叶烟等6科10种指示植物。

目前CMV传统的诊断方法主要有：病毒分离及用免疫学方法诊断抗原。包括常规的RT-PCR、ELISA技术和基因芯片技术。

但是，在PCR检测中有一些关键性限制因素，易导致假阳性或假阴性结果出现；ELISA检测是由于抗原抗体反应的专一性使其具有有限性；目前普遍看好的基因芯片技术因其需要昂贵的芯片制作系统，操作复杂、费时，对操作人员的专业素质要求比较高而难以推广应用。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种核酸扩增技术，由Notomi在2000年提出。它是由于4种引物与靶基因上的6个不同部位完全匹配，才能进行扩增因此能获得比PCR更高的特异性；LAMP一般能检测到比PCR至少低10倍的拷贝数，尤其是对于低浓度的病毒数量或无症状的病毒携带者的检测比PCR的效果更好；LAMP是恒温扩增反应比PCR反应速度更快，而且成本低，易推广。它只需一个简单的恒温器，不需要昂贵的PCR仪，对操作人员的分子生物学技能要求不高。产物检测便捷：LAMP反应可合成10⁹数量级的DNA，同时产生大量的焦磷酸根离子，它们能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据反应体系中是否形成白色沉淀来可视化定性判断LAMP反应结果。此外，还可进行凝胶电泳，浊度仪根据产物浑浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析，还可以直接肉眼检测或者在反应体系中加入荧光染料，观察变色情况。

该方法成本低廉，操作简单，只需台水浴锅、PCR仪就可在基层推广，LAMP技术因其快速、高效、特异性好、灵敏度高和经济等优点，已广泛应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测领域，具有广阔的发展应用空间。

然而，黄瓜花叶病毒是RNA单链病毒，容易发生变异，而且不同变异株之间会有许多突变位点，因此，利用LAMP技术检测浸染百合的黄瓜花叶病毒的难点在于保守序列的选择和引物的设计，方法灵敏度较高，还需要严格的防污染措施来避免假阳性结果。

目前，LAMP技术还未被应用于侵染百合的黄瓜花叶病毒的检测。

发明内容

本发明旨在提供一种检测黄瓜花叶病毒的LAMP引物、试剂盒及检测方法，该引物特异性强，与常见侵染百合的其它7种病毒无交叉，灵敏度高，可在模板纯度只有10¹拷贝数下进行扩增，建立的黄瓜花叶病毒的LAMP诊断方法，具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点。

一种用于检测黄瓜花叶病毒的LAMP引物组，其包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，从5’端到3’端，具体序列如下：

F3:5'-CCACCCAACCTTTGTAGG-3'；

B3:5'-CGGCAAAGGATTAACTCGA-3'；

FIP:5'-GTCTATTTTTGGTGGCTTTAGGGTTTTTGAGTGAACGCTGTAAACCT-3'；

BIP:5'-CGTGGGTCTTATTATGGTAAAAGGTTTTTATTTGAATGCGCGAAACA-3'。

本发明提供一种包含所述LAMP引物组的黄瓜花叶病毒的LAMP检测试剂盒。

进一步，所述LAMP检测试剂盒包含LAMP反应体系，该LAMP反应体系包括：内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、10×buffer、Mg²⁺、dNTPs、甜菜碱和Bst DNA聚合酶，其中，内引物与外引物的浓度之比的范围为8-16：1。