[发明专利]免药物筛选快速获得小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的方法

说明书

本发明提供了一种免药物筛选快速获得小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的方法，其包括以下步骤：1)选择小鼠Rosa26基因打靶位点；2)设计靶向Rosa26的gRNA；3)构建CRISPR/Cas9表达质粒pX458‑Rosa26；4)构建无启动子的带红色荧光报告基因的同源重组供体载体；5)细胞转染：将所述CRISPR/Cas9质粒pX458‑Rosa26与供体载体共转染进入小鼠ES细胞；5)用流式细胞技术先通过绿色荧光分选出成功转染质粒的细胞进行培养7天后，通过红色荧光进行单细胞分选，经培养获得定点整合外源基因的ES单克隆细胞系。本发明的方法精确快速、简便高效。

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，具体涉及一种免药物筛选快速获得小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的方法。

背景技术

成簇规律间隔短回文重复(Clustered regulatory interspaced shortpalindromic repeat，CRISPR)技术是近年来新发展的基因组编辑技术，其通过引导核酸内切酶切割DNA靶位点序列，形成DNA双链断裂(DNA double-strand break，DSB)，从而诱导细胞进行DNA损伤修复，然后通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)/同源重组(homology-directed repair,HDR)途径实现基因组编辑，包括基因敲除(KnockOut)、基因定点突变及外源基因的定点整合(KnockIn)。CRISPR/Cas9技术通过人工合成的sgRNA序列特异识别靶位点，引导Cas9蛋白进行DNA双链切割。近些年来，CRISPR/Cas9技术以高效、精准的特点在基因敲除方面得到了广泛应用。

外源基因的定点整合依赖于HDR修复途径，然而细胞内发生DNA双链断裂后的主要修复机制是NHEJ——往往导致单碱基的缺失、插入从而实现基因敲除，这导致了基因KnockIn的难度远大于KnockOut，因此在进行基因KnockIn时选择高效的编辑工具和有效的筛选方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种简便、快速、高效、精确的小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的方法。

为了实现以上目的，本发明提供了一种免药物筛选快速获得小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的方法，其包括以下步骤：

1)选择小鼠Rosa26基因打靶位点；

2)设计靶向Rosa26的gRNA；

3)构建CRISPR/Cas9表达质粒pX458-Rosa26；

4)构建无启动子的带红色荧光报告基因的同源重组供体载体；

5)细胞转染：将所述CRISPR/Cas9表达质粒pX458-Rosa26与供体载体共转染进入小鼠ES细胞；

6)用流式细胞技术先通过绿色荧光分选出成功转染质粒的细胞进行培养7天后，通过红色荧光进行单细胞分选，经培养获得定点整合外源基因的ES单克隆细胞系。

优选地，所述CRISPR表达质粒的gRNA的Oligo序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述步骤3)中，将两条Oligo序列混合并稀释至10μM，退火并复性使形成双链结构；退火程序为37℃，30分钟；95℃，5分钟；-5℃/min降至20℃；然后将退火后的双链以1：200比例稀释后，取1μL，加入100ng的pX458空载体；再加入BbsI酶使所述pX458空载体线性化并加入T4连接酶使带有粘性末端的双链与所述pX458空载体连接，得到pX458-Rosa26质粒。

优选地，所述步骤3)还包括将连接好的所述pX458-Rosa26质粒转入DH5α感受态中，涂板，扩大培养。