[发明专利]非肽基聚合物‑胰岛素多聚体和生产其的方法

说明书

本申请是分案申请，原申请的申请日为2012年6月1日，中国申请号为201280038302.7，国际申请号为PCT/KR2012/004368，发明名称为“非肽基聚合物-胰岛素多聚体和生产其的方法”。

技术领域

本发明涉及非肽基聚合物-胰岛素多聚体，其包括两个或更多个通过经共价键连接非肽基聚合物和胰岛素制备的非肽基聚合物-胰岛素缀合物，其中缀合物与钴离子络合以形成多聚体；制备该多聚体的方法和试剂盒；包括该多聚体作为活性成分预防或治疗糖尿病的药物组合物；和通过给对象施用该组合物预防或治疗糖尿病的方法。

背景技术

胰岛素由51个氨基酸组成，并且分子量为5808道尔顿(Da)。胰岛素在胰腺中胰岛的β细胞中产生，并且储存为六聚体(六个胰岛素分子的单元)，然后以生物活性单体形式吸收入血管。通过锌离子的配位和三个二聚体之间的疏水相互作用促进六聚体形成。六聚体中，存在两个金属离子结合位点并且源自三个二聚体的三个组氨酸残基涉及每个位点。根据胰岛素六聚体的结构状态(T或R状态)，结合位点位于六聚体的两端或自表面穿过中心的通道结构(tunnel structure)的底部。

目前，大部分商业重组体胰岛素和胰岛素类似物作为六聚体制剂存在。即，它们通过在包含六聚体-稳定化合物、锌和苯酚(或甲酚)的缓冲液中包括3mg/mL或更多的胰岛素进行配制。与单体形式相比，六聚体制剂提供卓越的原纤维形成和脱氨抗性，从而提高胰岛素的稳定性并且延长有效期。而且，皮下注入之后，六聚体制剂显示比单体形式更缓慢从注入位点吸收入血液，并且因此它们具有持续作用的优势。根据之前的研究，分子大小和在贮留(depot)处毛细管渗透性之间的反比关系解释该缓慢吸收速率。六聚体的这些性质应用于近来开发的长效胰岛素类似物，以使得在皮下注入之后延迟或持续吸收胰岛素。代表性例子是地特胰岛素(insulin detemir)，其通过将脂肪酸链附连至在天然胰岛素B链29位处的赖氨酸制备(Havelund等，2004)。根据该研究，尽管注入的地特胰岛素在体内形成双六聚体(dihexamer)，其通过与白蛋白的疏水相互作用形成大的分子络合物。因此，皮下半衰期——皮下注入药物的一半经过毛细管壁所用的时间——比天然胰岛素六聚体长4倍。

但是，六聚体制剂是有劣势的，因为它们不能被应用于在天然胰岛素的B链上的第一氨基酸苯丙氨酸处具有修饰的胰岛素类似物，这是因为苯丙氨酸残基涉及六聚体的结构稳定性。根据之前使用聚乙二醇化胰岛素的研究(Hinds等，2000)，当通过UV-圆二色性和沉降平衡分析通过将750Da或2,000Da大小的PEG附连至天然胰岛素的B链的氨基末端制备的胰岛素类似物时，它们的大部分作为单体在0.1-1.0mM的浓度范围内存在。相反，天然胰岛素大部分作为六聚体在相应浓度范围内存在。因此，使用配制的聚乙二醇化胰岛素六聚体在皮下注入之后难以具有持续吸收胰岛素的优势。胰岛素类似物的其他例子是白蛋白-胰岛素缀合物、糖基化胰岛素或类似物。

所以，急需开发诱导胰岛素类似物的多聚体形成的制剂，用于提高它们的药学性质，比如稳定性和持续性。

发明内容

技术问题

所以，本发明人使用钴离子诱导PEG-胰岛素六聚体的形成，并且然后分析它们的药学性质。结果，发现根据从微摩尔(μM)至纳摩尔(nM)的逐渐浓度变化发生PEG-胰岛素六聚体解离成单体，其流体力学体积与PEG-胰岛素缀合物和胰岛素六聚体相比大大增加，并且与商业长效胰岛素相比，PEG-胰岛素六聚体保持稳定的六聚体形式，从而完成本发明。

问题的解决方案

本发明的一个目的是提供非肽基聚合物-胰岛素多聚体，其包括两个或更多个通过经共价键连接非肽基聚合物和胰岛素制备的非肽基聚合物-胰岛素缀合物，其中缀合物与钴离子络合以形成多聚体。

本发明的另一目的是提供非肽基聚合物-胰岛素多聚体的制备方法，包括使非肽基聚合物-胰岛素缀合物与包含钴离子的溶液反应以产生非肽基聚合物-胰岛素多聚体。

本发明的仍另一目的是提供预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包括非肽基聚合物-胰岛素多聚体作为活性成分。

本发明的仍另一目的是提供预防或治疗糖尿病的方法，其包括向患有糖尿病或怀疑患有糖尿病的对象施用所述药物组合物的步骤。