[发明专利]一种表达蔗糖磷酸化酶的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种表达蔗糖磷酸化酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明将SEQ ID NO.1所示基因在大肠杆菌中异源表达，构建得到重组大肠杆菌并用其发酵产重组蔗糖磷酸化酶，使发酵上清液中的酶活达40U·mL^‑1。利用该重组蔗糖磷酸化酶催化蔗糖和对苯二酚生成α‑熊果苷，转化率可达91％。具有较好的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种表达蔗糖磷酸化酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

蔗糖磷酸化酶主要分布在细菌中。根据文献报道该酶的生产菌株很多包括L.mesenteroides、Streptococcus mutans、Pseudomonas saccharophila、Bifidobacterium longum、B.adolescentis以及B.megaterium等来源。

蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,以下简称SPase)主要能够催化两种类型反应：一种是以磷酸化的葡萄糖当作供体转移到不同的物质，蔗糖可以通过这种方式转化合成；另外的一种催化方式是把酶分解蔗糖得到的葡萄糖基转移至不同类型的受体，通过这种方式可以生成多种新的产物。

蔗糖磷酸化酶的应用价值广泛，有极强的葡萄糖苷转移活力，结构也较稳定。应用SPase的这种特性，以HQ为受体蔗糖为供体，催化合成糖基化的物质。日本Kitao等用来源于L.mesenteroides的SPase，将2g的对苯二酚可以转化得到2.3g的α-熊果苷。李群良等利用SPase转化合成α-熊果苷，可以得到35g·L^-1的α-熊果苷，对苯二份的转化率为74％。万月佳等利用重组的大肠杆菌生产蔗糖磷酸化酶，然后在1.6％的对苯二酚浓度下转化生成α-熊果苷，转化率为78％。提高其在胞内的表达水平，优化蔗糖磷酸化酶的酶转化生产α-熊果苷的条件，有很重要的意义。

作为一种国际上正在极力推广的高功效医药、化妆品添加剂，α-熊果苷在国内外有巨大的需求，在化妆品美白祛斑领域占据重要的地位。随着消费者了解的深入，α-熊果苷一定能在中国有更广阔的应用。据调研α-熊果苷的市场价值约每公斤3800元，而其原料对苯二酚的市场价值约66元每公斤，所以α-熊果苷是一种高附加值的产物，如果能够实现产业化生产将会为我国带来非常大的经济收益。

目前，在中国关于α-熊果苷的制备的研究相对较少，实现其工业化所面临的问题为缺乏转化率高且表达量高的酶。国内外对α-熊果苷合成的报道中转化率最高的为Dong-Ho Seo等利用Deinococcusgeothermalis来源的淀粉蔗糖酶在供受体比例为10：1时加入抗氧化剂，可将90％的对苯二酚转化为α-熊果苷，产物产量仅为0.56g·L^-1。但由于酶性质不稳定，底物浓度较低，供受体比例太高导致淀粉蔗糖酶不适合作为一种可以工业化酶。所以为了实现α-熊果苷的工业化，必须寻找具有性质稳定，表达量高，转化率高的特点的酶。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌，是将来源于L.mesenteroides的蔗糖磷酸化酶的基因异源表达，所述编码蔗糖磷酸化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体，大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-24a(+)为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达SEQ ID NO.1所示基因。

本发明第二个目的是提供一种构建表达蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌的方法，是将SEQ ID NO.1所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。