[发明专利]利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法

权利要求书

1.一种利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有L-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得spoT基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸。

2.根据权利要求1所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：采用spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT，通过发酵的方法生产得到L-苏氨酸。

3.根据权利要求2所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT通过下述方法构建得到：

首先，制备菌株ATCC21151的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段spoTknock1转化ATCC21151/pKD46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT1-F/spoT1-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT::SacBCm；最后，利用基因片段spoTknock2转化ATCC21151ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为ATCC21151ΔspoT，至此L-苏氨酸生产所用的菌株spoT基因缺失的菌株ATCC21151ΔspoT构建完毕。

4.根据权利要求1所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：采用spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT，通过发酵的方法生产得到L-赖氨酸。

5.根据权利要求4所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT通过下述方法构建得到：

首先，制备菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*的感受态细胞；利用质粒pKD46进行转化，获得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm；最后，利用基因片段spoTknock2转化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT::SacBCm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物spoT2-F/spoT2-R进行验证，验证正确的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT，至此L-赖氨酸生产所用的spoT基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔspoT构建完毕。

6.根据权利要求5所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通过下述方法构建得到：

利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pWSK29为出发载体，包含dapA基因表达框和lysC基因表达框的质粒pwsk-lysC-dapA；

以质粒pwsk-lysC-dapA为基础构建dapA和lysC突变体过表达质粒，得到质粒pwsk-lysC*-dapA*；

将质粒pwsk-lysC*-dapA*电转化至大肠杆菌MG1655；获得的菌株命名为MG1655/pwsk-lysC*-dapA*。

7.根据权利要求3或5所述的利用spoT基因缺失菌株通过发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于：所述基因片段spoTknock1和spoTknock2通过以下方法构建得到：

首先，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物spoTup1-F/spoTup1-R和spoTdown1-F/spoTdown1-R，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到spoT基因上下游个600-700bp的同源臂基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，67℃20s，72℃30s，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒ploi4162基因序列，设计引物SacBCm-F/SacBCm-R，以质粒ploi4162为模板，PCR扩增氯霉素(Cm)和蔗糖致死基因(SacB)基因序列，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃1.5min，循环30次；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC1-F/pUC1-R，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸10min；获得基因片段通过凝胶电泳回收；

利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，构建可用于扩增敲除spoT基因的基因片段的载体，华大基因公司测序正确后，质粒命名为spoT1；根据质粒spoT1基因序列，设计引物spoT1-F/spoT1-R，以质粒spoT1为模板PCR扩增第一次spoT基因敲除的基因片段spoTknock1，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，58℃20s，72℃2.5min，循环30次；获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行spoT基因第一轮敲除；

然后，根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物spoTup2-F/spoTup2-R和spoTdown2-F/spoTdown2-R，以大肠杆菌MG1655基因组为模板PCR扩增得到spoT基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，62℃20s，72℃30s，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒pUC18基因序列，设计引物pUC2-F/pUC2-R，扩增线性pUC18基因片段，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃1.5min，循环30次；72℃延伸10min；获得基因片段通过凝胶电泳回收；

利用MultiS One Step Cloning Kit对上述获得片段进行连接，构建可用于扩增敲除spoT基因的基因片段的载体，经华大基因公司测序正确后，质粒命名为spoT2；根据质粒spoT2基因序列，设计引物spoT2-F/spoT2-R，以质粒spoT2为模板PCR扩增第二次spoT基因敲除的基因片段spoTknock2，PCR扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃2.5min，循环30次；获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行spoT基因第二轮敲除。