[发明专利]适用于FFPE样品的基因表达定量的实时定量PCR方法

说明书

本发明涉及核酸分子定量的方法，具体而言，涉及适用于石蜡组织切片(FFPE)样品的基因表达定量的实时定量PCR方法，该方法包括1)反转录反应阶段；2)预扩增反应阶段；和3)巢式内扩增qPCR反应阶段。与传统的反转录qPCR相比，本发明的方法即保证了反转录、qPCR反应的特异性，又降低了反应所需底物的浓度，可以使qPCR的检测灵敏度提高500倍以上，尤其适用于低质量和/或低浓度的石蜡组织切片提取的mRNA的定量检测。本发明的方法可以极大地提高此类检测的灵敏度和可靠度。

技术领域

本发明涉及核酸分子定量的方法，具体而言，涉及适用于石蜡组织切片(FFPE)样品的基因表达定量的实时定量PCR方法。

背景技术

基因表达调控水平的定量经常用于医学诊断和生理、生物学通路功能研究。特定基因表达水平的变化可以作为某些疾病诊断的分子信号，一些疾病预后诊断方法，如乳腺癌远端复发预测诊断(Oncotype DX)，依据16个癌症相关的基因和5个管家基因的表达水平，确定乳腺癌术后远端复发风险。由于诊断方案检测的样本对象为福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。福尔马林固定-石蜡切片的组织样本是临床上病理分析最为常见的样品，但其在制备过程中，mRNA的完整度会遭到破坏。另外，poly A结构也会大量降解，造成反转录反应的低效率甚至反应失败。而且因为石蜡切片中目的细胞(如癌变细胞)的含量往往非常少，给基于此类样品基因表达水平检测的诊断方法造成困难。目前对于基因表达水平的检测最常用的技术平台为反转录实时定量PCR(RT-qPCR)方法，例如Oncotype DX乳腺癌远端复发预后诊断等。qPCR对基因表达水平的定量采用最广泛的是相对定量法，在基因水平上测量目标基因和参照基因的相对表达差异(delta CT法)；在生物学水平上测量基因相对表达在不同样品间的差异(delta-delta CT法)反转录实时定量PCR方法在实验上分为两步法和一步法。两步法RT-qPCR将反转录反应和qPCR反应分开。第一步反转录反应常以多重T引物(polyT)或者6碱基随机短片段作为通用反转录引物进行转录反应。反转录反应的产物经过稀释(或者原液)再进行采用基因特异性引物扩增的第二步qPCR反应。两步法RT-PCR的优点是反应体系简单，采用通用引物进行多基因同时反转录，避免了不同的反转录引物反转录效率偏好性的缺点。但也有明显的不足，如通用引物针对某个基因的反转录引物有效浓度不高导致的反转录效率低下，或者样品降解严重时反转录引物失效等等。

而传统的一步法RT-qPCR将反转录反应和PCR反应置于一个反应体系中，其中PCR的3'端引物同时作为基因特异性反转录引物和qPCR引物。在同一反应体系下先后进行反转录和PCR反应，传统一步法qPCR的优点是采用基因特异性引物作为反转录引物，大大提高了针对目标基因的反转录引物浓度。但其缺点也非常明显，亦即其反转录引物和PCR反应引物为同一个片段，其退火温度设置为PCR的退火温度，大大高于反转录酶耐受的反转录温度，在远低于引物的标准退火温度条件下，会造成大量的非特异性反转录，而这些非特异性反转录产物因其含有PCR引物匹配序列，也会在下一步的PCR反应中造成干扰。另外因为引物的设计是针对PCR反应的，其引物浓度和退火温度并未考虑反转录反应的优化。基因特异性反转录引物在统一反转录条件下会表现出不同反转录效率，这也会造成下一步qPCR对不同基因定量表达造成较大系统误差，造成检测和诊断的不准确。为了提高针对福尔马林固定、石蜡包埋组织切片等低质量或者/和少量mRNA RT-qPCR定量的灵敏性和准确度,已经有部分工作如提高RNA提取质量和改善试剂(采用更高温度耐受的反转录酶)等，这些方法对于所述目的贡献度有限，不能达到实际的目的和要求。