[发明专利]一种促进未成熟卵母细胞体外成熟的培养基及其应用

说明书

本发明涉及一种促进未成熟卵母细胞体外成熟的培养基及其应用。本发明通过研究不同的添加物对未成熟卵母细胞的作用，筛选出一种能促进未成熟卵母细胞体外成熟的培养基，该培养基是在常规卵母体外成熟培养液中添加20‑100μM的BAPTA‑AM而制得，该培养基安全无毒副作用，能够使未成熟卵母细胞特别是三级卵丘‑卵母细胞复合体中的卵母细胞减数分裂，提高该类细胞的体外发育能力，促进细胞成熟，提高细胞成熟后的孤雌激活后卵裂率和囊胚发育率，进一步提高胚胎质量。本发明培养基的应用为动物胚胎的体外繁殖技术提供了有利支持，应用前景良好。

技术领域

本发明涉及一种促进未成熟卵母细胞体外成熟的培养基及其应用，属于繁殖生物学技术领域。

背景技术

繁殖生物学上，胚胎生产需要大量卵源，一般会采取从屠宰后动物卵巢直接获得的卵母细胞，或者采用活体采卵的方式，从活体动物的卵巢获取卵母细胞，但是，由于从卵巢获取的卵母细胞并未完全成熟，因此需要通过一段时间的体外成熟培养，将未成熟卵母细胞培养成熟后，才能完成后续的体外授精、发育为胚胎等阶段，真正实现繁殖生产。

哺乳动物的卵巢含有大量未成熟卵母细胞，因此，从卵巢直接取未成熟的卵母细胞出来进行体外成熟培养是获取大量成熟卵母细胞最有效、最经济的途径，可以实现大规模的优良品种遗传物质商业化生产，也由此建立了很多卵母细胞体外培养的体系，卵母细胞形态与其成熟，受精，发育等能力之间的关系已经明确。但是体外成熟的卵母细胞与体内成熟的相比，仍然具有很大差距，因为从卵巢抽取而得的卵母细胞中大多数都没有发育成熟，常规从卵巢中获得的未成熟卵母细胞又称为卵丘-卵母细胞复合体，即COCs，分为四级，一级卵COCs胞质均匀，周围有5层及以上颗粒细胞；二级COCs胞质均匀，周围有2～4层及以上颗粒细胞；三级COCs胞质不均匀、周围有2层以下或部分裸露颗粒细胞；四级COCs并不成形。COCs可以通过目前的培养体系进行体外成熟培养，发育为可用的成熟卵母细胞，一级COCs约有80％左右能通过常规的体外成熟培养成为成熟可用的卵母细胞，二级COCs约有40％左右能通过常规的体外成熟培养成为成熟可用的卵母细胞，三级COCs是抽取到的卵母细胞中数量最多的一种，但是采用常规体外成熟培养体系只有30％左右能发育成熟，四级COCs不能发育成熟，只能弃置。但是，采集到COCs里，一级和二级COCs都只有少量，数量最多的为普遍认为不可用的胞质不均匀、周围颗粒细胞有2层以下或部分裸露的三级COCs。

如果通过体外成熟培养，能把每次取卵获得的数量最多的三级卵丘-卵母细胞复合体能发育成为成熟的卵母细胞，这就可以为育种、克隆、性别控制、细胞核移植、转基因动物生产等提供丰富的成熟卵源，变废为宝。对高价值的种畜来说能够扩大其优秀基因的传播，对人而言更是可以减轻取卵的痛苦，对很多卵巢功能衰退的大龄女性来说，也看到了利用自身卵子生育后代的希望。

BAPTA-AM(1,2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四乙酰氧甲基酯)是选择透过性膜Ca²⁺螯合剂，进入细胞后在脂酶作用下释出BAPTA，快速与Ca²⁺络合，控制细胞内钙水平，是研究Ca²⁺对细胞功能调节作用的标准的科研工具药，具有以下优点：对Ca²⁺选择性强、亲和力强，结合及解离速度快；稳定并受pH影响小；化学计量简单，与Ca²⁺结合比是1:1；对细胞安全性高，容易进入细胞而对细胞没有损伤，有效剂量范围内没有毒性。有研究证明Ca²⁺激活核酸内切酶是细胞凋亡过程中产生DNA碎片的原因，BAPTA-AM络合Ca²⁺后，抑制了核酸内切酶的活性，保护细胞。但是尚不确定BAPTA-AM能否促进三级卵丘-卵母细胞复合体的体外成熟培养，并用于胚胎生产，目前也尚无此方面的研究报道。

发明内容

本发明目的是提供一种促进未成熟卵母细胞体外成熟的培养基。本发明的另一目的是利用该培养基体外促进卵丘-卵母细胞复合体成熟的方法。

本发明提供的促进未成熟卵母细胞体外成熟的培养基中含有BAPTA-AM。