[发明专利]一种悬浮驯化293T细胞的方法

说明书

本发明提供了一种制备低血清培养的悬浮293T细胞系的方法，该方法包括：(1)复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的该293T细胞，用胰酶消化；(2)用添加了一定量血清的无血清培养基培养该贴壁培养的293T细胞，连续培养该293T细胞至适应该添加了一定量血清的无血清培养基；以及(3)重复步骤(2)中的该连续培育程序，逐渐降低该无血清培养基中的血清添加量至血清浓度为0，得到该悬浮培养的293T细胞。本发明操作简单，方便使用，费用低，安全性好。293T细胞悬浮培养的体外扩增培养方法无需特殊设备，操作简单可行。293T细胞悬浮培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景。

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种悬浮培养细胞的方法。

背景技术

体外细胞的培养方法包括贴壁培养和悬浮培养，贴壁培养(是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养；悬浮培养通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法；其中悬浮培养又可分为微载体悬浮培养及全悬浮培养。与贴壁培养相比，悬浮培养具有如下优点：(1)可连续扩大生产量；(2)有利于细胞培养基中的营养物质和气体充分接触，而且易于控制培养条件(温度、pH、氧分压和CO2等)；(3)培养条件稳定，趋于均一，便于进行定量研究；(4)易于在连续密闭的系统中进行，减少了操作步骤和污染的机会；(5)可以长期连续培养，既可节省人力，又使细胞能持续维持在对数生长期；(6)悬浮培养的细胞仍保持原先对病毒的敏感性和生物学特性。

293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293细胞属于贴壁细胞系，在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中，现有技术中，实验证实细胞传代次数过多对293细胞单层培养方式下细胞的生长产生了明显的影响。293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用Ca3(PO4)2转染效率可高达50％。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性磷酸酶分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外(分泌的或膜)蛋白的便捷方式。

现阶段工业化单层培养293T细胞时，培养基中均加一定比例的牛血清(包括胎牛血清或新生牛血清)细胞才能正常生长，牛血清不仅价格贵，而且牛血清来源于自然生物体，牛源本身携带和采集加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，使用会存在生物安全风险。另外，牛血清是一种天然混合物，其具体成份目前还没有完全分析清楚，生物制品生产中使用后对下游纯化工艺造成困难，如果有残留通常会引起接种者的副反应而影响产品质量。生物制品生产中细胞培养如能采用无血清全悬浮工艺，培养规模就容易线性放大，避免了细胞贴壁培养和使用牛血清带来的工艺缺陷，可提高病毒产量和产品质量，但是驯化无血清全悬浮培养型细胞株是目前最关键的技术瓶颈之一。

发明内容

针对以上原因，本发明提供了一种贴壁细胞进行悬浮培养的方法，本方法通过逐级降低胎牛血清的浓度，充分利用了悬浮培养的优点，使得贴壁细胞可以进行简化、高效、大量的培养。

本发明提供了一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞的方法，该方法包括：(1)复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的哺乳动物细胞，用胰酶消化；(2)用添加了一定量血清的无血清培养基培养该贴壁培养的哺乳动物细胞，连续培养该哺乳动物细胞至适应该添加了一定量血清的无血清培养基；以及(3)重复步骤(2)中的该连续培育程序，逐渐降低该无血清培养基中的血清添加量，直至最后血清含量为0，最后把悬浮细胞放到摇床上摇动培养。

优选地，所述步骤(1)中的哺乳动物为293T细胞。

优选地，所述步骤(2)和(3)中的所述无血清培养基包括Free style。