[发明专利]一种拟南芥γ‑INF诱导的溶酶体巯基还原酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶(AtGILT)基因及其应用。

背景技术

1988年，Luster等人发现了GILT，并且将之命名为IP30。它以可溶性糖蛋白前体的形式结合到甘露糖-6-磷酸受体上，经胞吞，N端和C端前肽被剪切形成了约30kDa的成熟形式，继而在溶酶体中酸性环境下发挥巯基还原活性，促进天然蛋白抗原的去折叠和进一步的蛋白酶解。GILT主要在抗原呈递细胞中表达，包括单核细胞/巨噬细胞、B细胞和骨髓来源的树突状细胞，可在其他细胞中如成纤维细胞和内皮细胞中可被γ-INF诱导表达。在胞吞作用途径中，GILT是唯一已知的酶催化还原剂，因此GILT可以调节许多细胞过程。以II型组织相容性抗原复合物(MHC class II)为基础的抗原呈递需要将天然蛋白加工成短肽以适应MHC的结合和T细胞受体(TCR)的识别。抗原呈递细胞中进行的抗原加工涉及抗原的变性、去折叠、二硫键还原及蛋白水解等等。在整个加工途径中，二硫键的还原是至关重要的步骤。GILT具有催化二硫键还原的活性，因此能够促进天然蛋白抗原的去折叠和进一步的蛋白酶解。

根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库记载可知，目前人类、多种动物的GILT cDNA已被克隆，并进行了一定程度的研究，而关于拟南芥GILT基因的研究，甚至整个植物GILT基因的研究在国内外还处于完全空白状态。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶基因，具有很强的巯基还原酶活性，满足使用需求。本发明的另一目的是提供上述拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶基因的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种克隆所述的拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶基因的方法，包括以下步骤：

1)提取拟南芥总RNA，逆转录为总cDNA；

2)以总cDNA为模板，以AtGILT-F1及AtGILT-R1为引物，通过RT-PCR方法获得PCR片段，克隆入pMD19-T载体，挑取阳性克隆测序获得目的基因序列；

其中，PCR体系为25μL：10μmol/L AtGILT-F1及AtGILT-R1引物各1μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10×DreamTaq buffer 2.5μL，cDNA模板1.5μL，DreamTaq酶0.3μL，加ddH₂O 16.7μL；

反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min；

引物AtGILT-F1序列为：5’-ATGGCGTCGATGCCGAGCAAACTTC-3’；

引物AtGILT-R1序列为：5’-TCATAGCAGGCCGGTGATGTCGATG-3’。

所述的拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶在免疫研究中的应用。

含有所述的拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶基因的表达载体或宿主菌。

所述的拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶基因的在制备具有巯基还原酶活性药物中的应用。

所述的拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶作为具有巯基还原酶活性物质中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明首次从植物拟南芥中克隆出γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶基因cDNA全长序列，并成功表达出溶酶体巯基还原酶蛋白，采用体外巯基蛋白酶活性检测方法测定体外表达的拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶对人IgG的巯基还原酶活性，结果显示该蛋白具有很强的巯基还原酶活性，在植物免疫研究领域将有广泛的用途。

附图说明

图1是AtGILT(拟南芥γ-INF诱导的溶酶体巯基还原酶)基因拷贝数Southern blot分析图；

图2是AtGILT基因表达模式分析图；

图3是AtGILT蛋白的原核表达图；

图4是AtGILT蛋白的肽指纹图谱；

图5是AtGILT体外巯基还原酶活性作用分析结果图。

具体实施方式