[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2表达及其ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2表达及其ELISA试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种猪的高度接触性的病毒性传染病，任何年龄的猪只均可感染该病毒，主要临床表现为妊娠母猪感染后出现流产、早产和死胎等繁殖障碍疾病，育肥猪和仔猪感染后主要表现呼吸道症状。其中，高致病性PRRSV可导致仔猪发病率100％、死亡率50％以上，母猪流产率30％以上。2006年，我国暴发高致病性PRRS疫情，波及20多个省份。当前流行现状十分复杂，猪群中流行的PRRSV毒株种类繁多，不同基因型或基因亚型的流行毒株致病性和分布存在差异，加之我国猪群普遍使用不同种类的疫苗，均给该病的诊断带来极大困难。PRRSV为不分节段，聚腺苷酸化、有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组长度约为15Kb，含有8个开放阅读框(ORFs)框。其基因基顺序依次为：5′-ORF1a-ORF1b-ORF(2-6)-ORF7-3′。ORF2～7编码6种结构蛋白，ORF1(包括ORF1a和ORF1b)编码的聚合蛋白裂解产生12个非结构蛋白(Nsp1～12)。Nsp2是PRRSV基因组中最容易发生变异的区域，因此可以通过对Nsp2的变异监测了解PRRSV基因变异的情况，研究者常把Nsp2作为PRRSV分子流行病学监测的靶基因。Nsp2是变异最大的非结构蛋白，并具有多个B细胞表位，在病毒的感染过程中能够刺激机体产生特异性抗体，并且这种抗体至少持续202d，提示Nsp2在PRRSV持续性感染的诊断中具有十分重要的意义。国内外多位学者研究发现，非结构蛋白Nsp2具有极强的免疫原性，可以诱导机体产生很高的抗体，甚至可以超过核衣壳蛋白(N蛋白)刺激机体产生的抗体水平，Nsp2在调节宿主免疫反应过程中扮演着十分重要的角色。体外表达的PRRSV NSP2融合蛋白也具有良好的免疫原性。本研究成功克隆了高致病性PRRSV贵州分离株PT株Nsp2基因的主要抗原表位的区域，并在大肠杆菌中高效表达，融合蛋白 能够被PRRS阳性血清所识别。以纯化蛋白为包被抗原初步建立的Nsp2-ELISA抗体检测方法敏感性高、特异性强，可用于PRRS的常规诊断及流行病学调查。ELISA是检测PRRS抗体最常用的方法之一，具有快速、经济、敏感及半自动化的优点，能自动显示结果，于短时间内大规模检测诊断大批量血清样品，方便易行，操作过程及结果判断能够标准化，且具有高度的特异性和敏感性，适于基层兽医部门和猪场对该病的诊断和血清学监测，是一种运用最广泛的方法。目前所建立的ELISA检测方法大多采用PRRSV全病毒或表达的核衣壳(N)蛋白作为抗原，本研究利用通过克隆表达贵州分离株PT株Nsp2重组蛋白，建立了检测Nsp2抗体的间接ELISA方法，此方法快速、有效、敏感、简便，有很好的应用前景。

发明内容：

具体地，本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2表达方法，包括以下步骤：PCR反应体系50L，由10×PCR Buffer 2-4L、MgCl2(25mM)1-5L、dNTP(10mM)1-3L，Nsp2-1/Nsp2-2引物各1-3L、Taq酶0.5-2L、cDNA适量1-3L、去离子水补足至50而成；PCR反应参数为：90-98℃2-4min预变性，然后进行30个循环，90-98℃，25-35s、52-60℃，25-35s、68-76℃40-60，最后68-76℃延伸4-6min；引物为Nsp2-15′-CGCGGATCCGACACCTCCTTTGATTGGAAT-3′，酶切位点BamHⅠ，Nsp2-25-CCGGAATTCCGAACCGTTAGGGACATTGTC-3，酶切位点EcoRⅠ，预扩增长度：606bp。