[发明专利]一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法，本发明先使用单链DNA与miRNA进行结合，再使用DSN酶对配对的单链DNA进行消化，最后通过Taqman方法对剩余的单链DNA进行定量，从而间接实现地对目标miRNA含量的检测。本发明避免了传统方法扩增时的非特异扩增问题，仍使用成熟的Taqman技术，应用极为方便、稳定。基于上述优点，本方法在肿瘤检测领域，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

miRNA是一类内源性长约22个nt的非编码微小RNA，有如下结构特点：miRNA普遍存在于真核生物中，它不编码蛋白质，本身不具有开放阅读框；成熟的miRNA并不是简单的RNA降解片段，它的5’端和3’端分别连接了磷酸基团和羟基，且5’端的第一个碱基对尿嘧啶(U)有强烈倾向性，而对鸟嘿岭(G)有一定抗性。miRNA基因序列并不是随机排列的，一些是成簇的(cluster)，而且簇生排列的基因常常协同表达；绝大多数的miRNA是由前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)的一条臂上加工而产生的，鲜有miRNA由Pre-miRNA的两条臂同时产生。miRNA的表达具有明显组织特异性和细胞特异性，还有一定的时序性，其序列还具有高度保守性的特点。

研究表明，miRNA调控人类约30％以上的基因表达,从而参与到多种生命过程。现有许多证据表明，miRNA表达水平异常与人类肿瘤发生有莫大关联。目前认为，miRNA的下调或上调可能导致原癌基因的激活或抑癌基因的抑制。miR-21在胃癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤疾病中表达水平上调,并且与胃癌等肿瘤的恶性程度呈正相关。miR-21的大多数靶mRNA是抑癌基因的转录产物,如PDCD4和PTEN等。miR-21的成熟序列为hsa-miR-21-5p MIMAT0000076：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO：5)。

主流的检测miRNA的方法是基于Taqman荧光定量PCR的，包括加PolyA尾法和茎环法。

加尾法的反转录引物实际上就是处理mRNA所用的通用oligo(dT)引物。在反转录前有一个步骤是为RNA样品加PolyA尾，然后反转录。所以它的反转录引物中包括:一段通用序列、一段多聚T和一个单碱基锚定。单碱基锚定的概念源于mRNA分析技术中的差异显示(Differential display)技术。其原理是借助mRNA的PolyA尾，对大量的mRNA进行分类。这种在多聚T后加上一个A或C或G的简并反转录引物，能将所有mRNA分类为3种，这就是单碱基锚定。

“茎环”即指反转录引物。茎环结构不但能有效地延长miRNA的长度，同时它自身互补的构象可以避免与其他同源基因结合，减少了非特异性扩增的几率。整个引物由2部分组成，一个通用的茎环结构和5～8个与目的miRNA的3'端反向互补的碱基。这种通用的茎环结构由Chen等设计，其序列为:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3'(SEQ ID NO：6)。其中下划线部分为茎环自身互补部分。随后在该序列的3'端加上5～8个碱基，与目的MicroRNA的3'端反向互补。

不论是加PolyA尾法还是茎环法，都需要进行逆转录，而其逆转录的过程，均存在引物特异性不够的问题，因而两种方法的特异性均达不到诊断试剂产品的要求。

双链特异性核酸酶(Duplex-specific nuclease，DSN)是来自红金蟹的一种特异性核酸酶，具有热稳定性，在60-65℃时具有最大活力，即使在70℃高温孵育20min后仍然具有25％的活力。DSN酶能切割双链DNA，以及DNA/RNA杂合链中的DNA，常备用于cDNA均一化处理。自2013年以来，一些使用DSN酶结合氧化石墨烯传感器、特异性磁珠、纳米金、分子信标等技术，用于miRNA检测。但是这些方法设计复杂、成本较高，不利于产业化。