[发明专利]一种检测免疫性血小板减少症血小板自身抗体的方法

说明书

技术领域：

本发明属于一种血小板临床试验研究时用来检测免疫性血小板减少症血小板自身抗体的具有较高特异性和敏感性的新型试验检测方法。

背景技术：

血小板减少症是临床上血液科常见疾病。根据发病机制的不同可分为免疫性血小板减少症和非免疫性血小板减少症。如何区分两者需要一种较高特异性和敏感性的血小板自身抗体试验检测方法。

目前血小板抗体的检测方法出现的早晚，可分为I期、II期及III期检查方法。I期检查出现于19世纪50年代至70年代，主要检测患者血清或血浆在体外对正常血小板功能的影响，所用的试验方法均是间接法，其敏感性和特异性均很低。II期试验方法在19世纪70年代发展起来，主要是检测血小板相关抗体。血小板相关抗体虽然有较高的敏感性但特异性较低。III期试验方法是在19世纪80年代中期发展起来的抗原特异性分析法。最近发展起来的糖蛋白俘获检查法-即单克隆抗体固定特异血小板抗原法，不仅可检测血小板特异性抗体(间接法)而且可检测血小板相关的特异性抗体(直接法)；并且血小板裂解发生在特异性抗体与血小板膜糖蛋白结合后，避免了去垢剂处理对自身抗原表位的破坏；试验中在分离的试管内洗涤致敏的正常血小板，阻止了血浆/血清与塑料的粘附，减低了背景干扰。血小板裂解发生在特异性抗体以及抗GP单克隆抗体与抗原结合之后，同时保护了特异性抗体及单克隆抗体的结合表位。但现已发现人血清中存在能与鼠抗体反应的嗜异性抗体，而上述方法同时孵育正常血小板、待测血清及鼠源性抗体，可能受到人抗鼠抗体的干扰，产生假阳性结果。因此传统的单克隆抗体固定特异血小板抗原法仍需适当的改进来提高试验结果的特异性和敏感性。

发明内容：

本发明的主要任务是为血小板临床试验研究提供一种具有较高特异性和敏感性的检测免疫性血小板减少症血小板特异性抗体的的新型试验检测方法。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1制备备抗体包被多孔板，每孔内加入羊抗鼠单克隆抗体(一抗)，过夜孵育后，加入抗血小板单克隆抗体，室温孵育备用；

2离心分离患者血清或血小板表面的血小板特异性抗体，加入正常人O型血小板，室温孵育，血小板溶解液溶解血小板，制成上清液；

3将上述上清液加入步骤1制备好的抗体包被多孔板，室温孵育，再加入碱性磷酸酶标 记的羊抗人单克隆抗体(二抗)，室温孵育；

4加PNPP/底物缓冲剂溶液，室温孵育至显色，观察结果；

5所有试验数据用配对T检验进行统计学分析。

本发明先将O型正常人血小板与患者待测血清或血小板洗脱液反应，洗涤后裂解血小板，离心取上清稀释后待用。在抗鼠抗体包被的多孔板中，先加入抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体(鼠抗人单克隆抗体)再加入稀释上清液，然后加入酶标二抗和底物，从而避免人抗鼠抗体与鼠单克隆抗体直接结合引起的干扰。

附图说明：

附图1是本发明的原理示意图。

具体实施方式：

本发明的检测步骤如下：

1.血小板表面抗体洗脱

(1)抽取抗凝血10ml(每10ml全血中加入1ml 5％的EDTA)。

(2)200转每分，10分钟，离心2次。

(3)取上清(富含血小板的血浆，PRP)，加入EP管离心(1000g，15分钟)取沉淀。

(4)沉淀用PBS/EDTA(1-1.5ml)洗两遍(1000g，15分钟)。

(5)弃上清，加入800ul改良Tyrode溶液。

(6)加入180ul 0.1MHCl，PH 2.8-2.9。

(7)20℃摇动水浴中10分钟。

(8)常温下离心，3900转/分，12分钟。

(9)取900ul上清，即刻加入80ul 0.2MNaOH中和。

(10)常温下离心，3900转/分，12分钟。

(11)取上清，标记，置-70℃保存。

2.多孔板抗体包被

(1)准备包被液10ml，抗体终浓度3ug/ml[17ul羊抗鼠单克隆抗体(1.8mg/ml)+10ml碳酸缓冲液]。

(2)加样，100ul/孔。

(3)塑料薄膜覆盖，4℃过夜。

(4)0.01M PRS/Tween洗涤两次(260ul/孔，甩干)。

(5)每孔加入封闭液(0.01M PBS/Tween/3％BSA)200ul，置室温下30分 钟。

(6)去除封闭液，控干。

(7)即用，否则应置-70℃，塑料薄膜覆盖。

3.单抗俘获